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【求助】切胶免疫高手请看过来!
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我想用SDS-PAGE电泳的胶切下目的条带来免疫动物.有如下几个问题请教:
1 切下的胶 在室温下经过考染 高脱 低脱是否可以?
2 经过上述处理的胶再放入-20中保存可以吗?能保存多长时间?
3 直接将胶条与免疫佐剂融合还是将胶条融化以后再融合呢?
请高手指点!查看完整版本请点击这里：
yysr238 ( 09:50:22)
看看这个帖子，介绍一种kcl染色液，切胶后要等蛋白浸出后再免疫
orangecake ( 09:50:40)
我的具体做法是切下考染的胶条（考染的胶不会致死兔子），用组织研磨器研碎，然后过几次2ml的注射器针头，以保证在免疫时凝胶颗粒不会堵塞针头。切下的胶存放－20度几个月应该没问题，你不放心的话，也可现免疫现制备胶。我是将胶研碎后与佐剂混匀的。
wood533 ( 09:51:01)
关于佐剂的问题，你需要和制备抗血清的地方联系，我是在遗传所做的兔血清，他们就不需要加佐剂。做的还可以，效价可达10000。不过还是那句话，方法没有一成不变的，只要做出来就是王道（引用某牛人）。^_^。
@STAR@ ( 09:51:20)
各位高手：
大家的意见真的很好！我再谈谈我的实验问题：
1、用考染的话，蛋白在胶中，那么在室温很长时间，对蛋白会不会有影响？
2、我试过用0.25mMKCL,不含有其他成分，但是目的条带显的不明显。
3、我们没有组织研磨器，用研钵加少许生理盐水可以吗？
4、有人说配胶的时候可以在浓缩胶时不插梳子，可以上样1毫升，但是不插梳子怎么上样啊？
请大家多多指教！
pencil菲 ( 09:51:44)
QUOTE:原帖由 @STAR@ 于
09:51 发表
各位高手：
大家的意见真的很好！我再谈谈我的实验问题：
1、用考染的话，蛋白在胶中，那么在室温很长时间，对蛋白会不会有影响？
2、我试过用0.25mMKCL,不含有其他成分，但是目的条带显的不明显。
3、我们没有组织研磨器，用研钵加少 ... 1.染色液的配方请见，经验所得，可以借鉴。
2.不插梳子的意思不是不上浓缩胶，而是上一半左右，但浓缩胶的的长度要够，至少要保证蛋白能压在一条线，配完后用水封，上样的时候去水直接上。
3.研磨最好用10ml左右或小一些的高压灭菌管
wood533 ( 09:52:02)
1，肯定有影响。考染只是作为一种蛋白的检测手段，检测完毕后，胶就可以丢弃了；如果想保存，可以制成干胶，这个也很好做。如果你要是想放一段时间的话，可以把胶浸泡在含有甘油的水中或脱色液中。
2，KCl染色就是这样，你可以先通过样品的预处理除去其他杂蛋白。我不知道你的试验是什么样子，但如果蛋白是包涵体的话，可以先逐步洗涤包涵体，最后可以把目的蛋白洗的很纯，在上样就容易多了。
3，组织研磨器很效，玻璃的，而且那是相当的便宜。还是推荐你用这个，起码我当初试了很多方法，就这个实用。
4，当然可以上样了，浓缩胶不要加到顶，留一段距离，这样胶和玻璃就可以形成一个很宽的梳孔。
@STAR@ ( 09:52:19)
感谢大家的回应：
我的实验做的是带6个His标签的蛋白，但因为i蛋白太大了，在Ni柱中纯化了很长时间，仍无法得到蛋白，因此，才想到用切胶免疫的。我现在的问题是：
1、用考染在室温下需要的时间比较长，这样的蛋白对免疫会不会产生影响？
2、在配浓缩胶时，不要加到顶，那不会从两边漏出来吗？
@STAR@ ( 09:52:40)
另外的问题
切胶免疫好像不能保证在无菌条件下进行，这对免疫动物不会产生影响吗？
wood533 ( 09:53:00)
1.考染过的胶是不能进行免疫的,会把兔子或鼠打死.
2.可能会有很少的一部分漏下去,但这不影响你的实验,切胶时,胶两侧的部分是不能要的.
3,没有影响.
@STAR@ ( 09:53:18)
今天的问题：
我试过了配胶 不插梳子，上样600微升，但跑出的胶一片模糊，真的不知道什么原因？我觉得可能是孔太大了吧！上样后跑的不均匀！
还有什么好的建议吗？我想免疫兔子，如果一个一个孔跑样实在是太慢了！该怎么办呢？
@STAR@ ( 09:53:39)
各位高手：
用制好的胶研磨后仍有较大颗粒，不知道不加佐剂行不行？另外，我试过用2毫升的注射器过一下，但发现很快就堵住了针孔，那么注射小鼠用注射器打岂不是很困难！请指点迷津！
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【求助】做完SELDI-TOF-MS，下一步能做什么？
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临床体液样本做SELDI-TOF-MS，如果做完后，找到蛋白表达谱，然后怎么办？如何继续下一步呢？有办法进行蛋白鉴定吗？能够进行和临床指标的相关分析吗？请高人指点！期盼中查看完整版本请点击这里：
yapuyapu ( 22:06:48)
多谢楼上指点! 您所提到的“2.先将临床体液样本跑Tricine–SDS-PAGE进行初步的分离，然后再切胶进行质谱鉴定（可使用ESI或MALIDI-TOF-MS）”，我认为很可能通过二维双向电泳及MALIDI-TOF-MS质谱鉴定出的差异蛋白和SELDI-TOF-MS中找到的差异蛋白不是同一种蛋白，分子量无法一致，出现这种情况怎么办？怎样才能把SELDI和MALDI有效的结合起来？请指教！
BUK ( 22:07:06)
你说的情况我也碰到过,我们也曾经用2-DE结合MALIDI-TOF-MS鉴定SELDI-TOF-MS找出来的差异蛋白,但效果不理想。我想是因为SELDI-TOF-MS找出来的都是低分子量的蛋白质或者是低丰度的蛋白质，而2-DE对低分子量的蛋白质的分辨率比较低，同时上样量的限制也使低丰度蛋白质难以检测，所以我们认为不能用通过二维双向电泳及MALIDI-TOF-MS质谱鉴定出的差异蛋白，我们才用了Tricine–SDS-PAGE进行初步的分离，然后再用MALIDI-TOF-MS质谱鉴定。
此外，你也可以用HPLC串联质谱来试试看。
希望以后有更多机会相互学习。你们现在主要做哪方面的研究？
bluelake ( 22:07:31)
请问在哪里可以做SELDI-TOF-MS，我要检测大样本的临床体液样本！
不知道在哪里做？怎么联系这些科研院所？
yapuyapu ( 22:08:28)
我在做尿液方面的，SELDI-TOF-MS的重复性太差，有人说，做SELDI-TOF-MS没有太大意义，究竟是做2-DE结合MALIDI-TOF-MS好呢？还是SELDI-TOF-MS好一些？或者两者都做？iceman8819 ，你用Tricine–SDS-PAGE进行初步的分离，那分离出来的应该是混合蛋白吧？你如何纯化的呢？能直接进行MALIDI-TOF-MS质谱鉴定吗？你认为SELDI-TOF-MS和2-DE结合MALIDI-TOF-MS，两者哪个更好一些？
kswl870 ( 22:08:48)
SELDI-TOF-MS的确有重复性太差的问题,但他是目前对小分子量蛋白检测比较灵敏的工具,SELDI-TOF-MS可以给你的研究提供一些有用的信息和思路 ，特别在寻找小分子量的蛋白方面。2-DE也有其技术上的不足，他也存在重复性差的问题，对同一样本你可以跑出不同的结果。我个人认为如果你是找10KD以上的蛋白，你可以选择2-DE结合MALIDI-TOF-MS进行研究，如果你是进行小分子量的蛋白研究，你可以用SELDI-TOF-MS进行初步的研究，得到相应的信息。
用Tricine–SDS-PAGE进行初步的分离，那分离出来的确是混合蛋白，你可以通过高效液相等技术手段进行分离纯化，这里应该有好多技术进行纯化，这样得到相对纯的样品后，你可以行MALIDI-TOF-MS质谱鉴定了，这一路线可以走得通的，你可以试试。
nikun230 ( 22:09:54)
,我公司对外承接临床体液样本的差异蛋白质组分析工作.采用德国BRUKER的Clinprot系统,利用液体芯片分离样品之后采用MALDI-TOF/TOF进行检测.随后还可对寻找到的差异分子进行二级质谱分析,可解决SELDI后续工作困难的问题
hustwb ( 22:10:21)
从已经发表的结果看，SELDI找出的蛋白算不得低丰度吧？
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【求助】求教高手 蛋白纯化 SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色后如何切胶质谱
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这个帖子发布于4年零63天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请问染色后想切下需要的条带然后送公司去做质谱
想知道切下来要如何处理
有什么注意事项
胶能保存多久
不知道邀请谁？试试他们
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你问问对方需要什么样的样品，一般直接把条带切下来装在Ep管捣碎，常温送过去就行了。脱色什么的自己做费时费力，不合算。胶上的蛋白性质很稳定，能保存很久。注意戴手套/发网操作，防止霉菌和角蛋白污染。
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谢谢！！！！！！！！！！！！！！下午网上查很多说要进行胶内酶切再去质谱的
能再给点意见不？？？
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darknesskou 谢谢！！！！！！！！！！！！！！下午网上查很多说要进行胶内酶切再去质谱的
能再给点意见不？？？打个电话问问公司能接受什么样的样品不就知道了，一般的公司都可以直接从胶条开始完成脱色，烷化，酶切，质谱这一整个流程。就和DNA测序一样，样品可以是甘油菌，穿刺菌，菌液，质粒, 酶切片断，乃至反应好的PCR产物，只要对方有能力处理这个样品就行了。
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谢谢！！！！！！！！！！！！！！！！！！
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laforet 打个电话问问公司能接受什么样的样品不就知道了，一般的公司都可以直接从胶条开始完成脱色，烷化，酶切，质谱这一整个流程。就和DNA测序一样，样品可以是甘油菌，穿刺菌，菌液，质粒, 酶切片断，乃至反应好的PCR产物，只要对方有能力处理这个样品就行了。话说。。。又想到个问题
今天看质谱的相关资料看到这么一句话&目前质谱主要测定蛋白质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置&
想到跑WESTERN BLOT的时候加的上样缓冲液里面含有巯基乙醇能够断裂二硫键
而且煮沸5分钟也会使蛋白变性
想再咨询下...如果需要割胶做质谱的话
蛋白上样要注意些什么...是不是要跑非变性胶...蛋白能不能煮沸...
再次麻烦了！！！！
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就跑普通的SDS-PAGE就可以的，样品处理和平时一样。一般做质谱的会希望你把整块胶拿过去，他们自己从胶上切下来条带然后他们负责胶内酶切以及后续处理。是为了你自己切的时候有时候切不干净又杂带污染。
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京京 就跑普通的SDS-PAGE就可以的，样品处理和平时一样。一般做质谱的会希望你把整块胶拿过去，他们自己从胶上切下来条带然后他们负责胶内酶切以及后续处理。是为了你自己切的时候有时候切不干净又杂带污染。楼主可知哪里提供切胶质谱鉴定蛋白分子量的服务？可否推荐下。谢谢!
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楼主可知哪里提供切胶质谱鉴定蛋白分子量的服务？可否推荐下。谢谢!自己google一下： 蛋白质质谱服务 。 可以么？darknesskou wrote:谢谢！！！！！！！！！！！！！！下午网上查很多说要进行胶内酶切再去质谱的
能再给点意见不？？？国内现在google是否经常不能用？ 大家怎么都不爱检索呢？你在google搜索“SDS PAGE FOR MASS SPECTROMETRY”，第一个结果就是一个具体的protocol啊！Preparation of samples for mass spectrometry from SDS-PAGE gelsThe procedures described below are for the analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) using a Q-Tof Ultima API mass spectrometer. The treatment of samples may vary depending on the type of analysis and the instrument used. It is best to consult with the mass spectrometry facility where the analysis is to be carried out for the processing of samples. In order to reduce the risk of contaminating the samples for mass spectrometry, particularly with keratins, work is carried out in a hood wearing double gloves, a lab coat and always using sterile plasticware.1.
Following electrophoresis by SDS-PAGE the gel is stained overnight with Colloidal Blue, according to the manufacturer’s instructions.2.
The gel is destained in several changes of ddH2O until the background (i.e. the non-protein-containing part of the gel) is completely destained. This usually takes several hours (more than 12 hours).3.
The destained gel is photographed to provide a record of the purification experiment.4.
20-25 microfuge tubes are rinsed with 60% acetonitrile.5.
The entire lane is cut out lengthwise and divided into 20-25 gel slices. Each gel slice is placed in a separate tube.6.
Each gel slice is destained in 100?l of destaining solution (25mM ammonium bicarbonate in 50% acetonitrile) for 20-30min. This step is repeated until the gel slice becomes completely destained (usually 3-4 times). Alternatively, gel slices can be destained overnight at 4oC.7.
Each gel slice is dehydrated in 100?l of 100% acetonitrile for 5-10min at room temperature. The gel slice becomes hard and white at this step.8.
The gel slices are reduced with freshly prepared 6.5mM DTT solution for 45-60min at 37oC.9.
The solution is discarded and proteins in the gel slices are alkylated by adding 100?l of 54 mM iodoacetamide solution and incubating for 60min at room temperature in the dark.10.
The solution is discarded and the gel slices are washed in 100?l of gel slice destaining solution for 15 min at room temperature. This step is repeated once more.11.
The washing solution is discarded and the gel slices are dried in 100?l of 100% acetonitrile for 10min. The solution is again discarded and the gel slices are dried at room temperature.12.
Proteins are in-gel digested in 15?l of 10 ng/?l modified trypsin at (diluted froma 100x stock prepared in 50 mM ammonium bicarbonate) for 30 min on ice (note: the volume of trypsin solution added will depend on the size of the gel slice. The volumes given above are for gel slices of approximately 4x2mm. At this stage, gel slices should swell and little solution should remain visible.).13.
15 ?l of 50 mM ammonium bicarbonate are added to the samples followed by overnight incubation at 37?C.14.
Samples are equilibrated to room temperature. 30?l of 2% acetonitrile in 0.1% formic acid are added to the samples and incubated at room temperature for 15 min. The samples are then vortexed briefly and sonicated for 1 minute.15.
The supernatants are collected in separate tubes and the remaining gel slices are treated with 30?l of 50% acetonitrile in 0.1% formic acid and incubated as above. Samples are again vortexed and sonicated as above and the supernatants are collected and pooled with the corresponding supernatants from step 14.16.
The samples are vacuum dried in a vacuum centrifuge for 45-60 minutes until they are dry.17.
The eluted peptides are now ready for analysis by mass spectrometry.
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我知道的军事医学科学院的仪器分析中心以及昌平的那的国家蛋白质中心提供服务
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我也在做SDS-PAGE考马斯亮蓝染色样品 用质朴技术观察。是从细胞内提出来的蛋白。想问一下跑电泳上样时对蛋白的量，蛋白的浓度，有没有要求。
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钝齿棒杆菌精氨酸生物合成关键酶分析
L-精氨酸是人体代谢的一种重要氨基酸。在食品和医药等方面有着广泛的应用前景。本文比较了的钝齿棒杆菌A.S.M2诱变菌和2株工程菌钝齿棒杆菌A.S.M2.sp、钝齿棒杆菌A.S.M2△argR发酵过程中L-精氨酸产量及其与各生长因素之间的关系，分析argR基因在钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径中的作用。采用偶联有L-精氨酸的Sepharose-4B亲和层析柱分离生物合成途径中受L-精氨酸反馈抑制的关键酶；并通过SDS-PAGE分离纯化各关键酶；将各纯化蛋白组分进行MALDI-TOF-MS分析，分析结果与蛋白组数据库进行比对。主要研究结果如下：
(1) 测定了钝齿棒杆菌A.S.M2，钝齿棒杆菌A.S.M2.sp，钝齿棒杆菌A.S.M2△argR三株菌的L-精氨酸生产曲线、菌体生长曲线、碳源消耗曲线、发酵液pH值变化曲线，结果显示钝齿棒杆菌A.S.M2.sp的L-精氨酸产量最高时达到85 mg/mL，推测argR基因在钝齿棒杆菌L-精氨酸生物合成途径中的可能起正调控作用；
(2) 采集各菌L-精氨酸产量高峰期的菌体，采用亲和层析技术分离纯化获得了钝齿棒杆菌A.S.M2和钝齿棒杆菌A.S.M2△argR2株菌的特异性吸附蛋白；
(3) 采用SDS-PAGE电泳分离纯化各蛋白条带，并切胶回收了主要的10个纯蛋白条带。各纯化蛋白组分进行MALDI-TOF-MS分析，10个蛋白点均获得质量较高的质谱峰图，与蛋白组数据库进行比对获得均为阳性结果。
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