中国细胞生物学学报（原名:细胞生物学杂志）
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gma-miR1507a生物信息学分析、植物表达载体的构建及遗传转化
马 玲 崔晓霞 黄颜众 赵晋铭 王海棠 郭 娜* 邢 邯*
(国家大豆改良中心, 农业部大豆生物学与遗传育种重点实验室, 作物遗传与种质 创新国家重点实验室, 南京农业大学, 南京 210095)
摘要　　miRNAs(microRNAs)是一类长度为18~25 nt的内源性非编码小分子RNA, 通过对其&&&&靶基因mRNA的降解或抑制翻译来调控基因表达, 进而参与调控植物相关的生理活动。该研究分析gma-miR1507a的成熟体序列、茎环结构和前体启动子区域的顺式作用元件并检测了逆境处理下大豆组织中gma-miR1507a的水平; 使用psRNATarget在线软件预测了gma-miR1507a的靶基因; 构建植物表达载体amiRNA1507a-pCAMBIA2301并转化大豆子叶, 获得了发状根。结果发现, gma-miR1507a前体的启动子区域存在与干旱胁迫和病菌侵染相关的顺式作用元件; 在线软件psRNATarget预测到9个gma-miR1507a的靶基因; 该研究利用发状根介导的遗传转化结合GFP染色,确定阳性发状根; 在转基因根毛中, gma-miR1507a水平与空载相比显著提高, 预测的部分靶基因表达量显著下调。以上结果显示, 过表达amiRNA1507a能够提高大豆发状根中gma-miR1507a水平,为研究gma-miR1507a的功能奠定基础。同时, gma-miR1507a可能参与调控大豆的逆境胁迫。
关键词　　gma-miR1507a; 顺式作用元件; 靶基因预测; amiRNA1507a表达载体构建; 发根农 杆菌转化
收稿日期: 　　接受日期:
国家自然科学基金(批准号: )、江苏省自然科学基金(批准号: BK)、国家公益性行业(农业)科研专项经费(批准号: )、转基因 生物新品种培育重大专项经费(批准号: 02-005)、长江学者和创新团队发展计划(批准号: PCSIRT13073)、大豆现代产业技术体系(批准号: CARS-004-PS10)和江苏省现代作物生产协同创新中心
*通讯作者。郭 娜* 邢 邯*
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２４９－２５４.??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????ｈｔｔｐ://ｎａｕｘｂ.ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎＤＯＩ:１０.７６８５/ｊｎａｕ.２０１５０５０２２孙文星?南文婷?谷淑华?等.ｍｉＲ￣２７ｂ及其靶基因ＰＰＡＲγ在肌内和皮下脂肪细胞中的差异表达分析[Ｊ].南京农业大学学报?２０１６?３９(２):
ｍｉＲ￣２７ｂ及其靶基因ＰＰＡＲγ在肌内和皮下脂肪
细胞中的差异表达分析
孙文星１?２?南文婷１?谷淑华１?韩海银１?李艳１?褚维伟１?陈杰１*
(１?南京农业大学动物科技学院?江苏南京２１００９５?２?南通大学公共卫生学院?江苏南通２２６０１９)
摘要:[目的]探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒγ?ＰＰＡＲγ)在肌内和皮下脂肪细胞中的差异表达及其与脂质差异沉积的关系?并从ｍｉＲＮＡｓ角度阐述ＰＰＡＲγ基因差异表达的机制?[方法]用油红Ｏ染色法检测肌内前体脂肪细胞与皮下前体脂肪细胞的分化聚脂能力?采用ｑＲＴ￣ＰＣＲ与Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＰＰＡＲγ在肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞中的表达水平?通过生物信息学预测靶向ＰＰＡＲγ的ｍｉＲＮＡｓ?利用ｑＲＴ￣ＰＣＲ检测候选ｍｉＲＮＡｓ在肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞中的表达水平?用双荧光素酶报告系统鉴定候选ｍｉＲＮＡｓ与ＰＰＡＲγ的靶向性?[结果]肌内前体脂肪细胞的分化聚脂能力显著高于皮下前体脂肪细胞(Ｐ&０.０５)?ＰＰＡＲγ的ｍＲＮＡ和蛋白在肌内脂肪细胞中的表达水平显著高于其在皮下脂肪细胞中的表达量(Ｐ&０.０５)?生物信息学预测得知ｍｉＲ￣１３０ａ、ｍｉＲ￣１３０ｂ、ｍｉＲ￣１２８、ｍｉＲ￣３０１、ｍｉＲ￣２７ａ和ｍｉＲ￣２７ｂ可以靶向ＰＰＡＲγ?其中ｍｉＲ￣２７ａ与ｍｉＲ￣２７ｂ在肌内脂肪细胞中的表达量显著低于其在皮下脂肪细胞中的表达量(Ｐ&０.０５)?荧光素酶活性分析表明?ｍｉＲ￣２７ｂ可以显著抑制ＰＰＡＲγ的荧光活性?[结论]在体外?与皮下前体脂肪细胞相比?肌内前体脂肪细胞具有更强的分化能力?ｍｉＲ￣２７ｂ在两种脂肪细胞中的差异表达可导致靶基因ＰＰＡＲγ的差异表达?进而引起肌内前体脂肪细胞与皮下前体脂肪细胞分化能力的差异?
关键词:皮下脂肪?肌内脂肪?过氧化物酶体增殖物激活受体γ(ＰＰＡＲγ)?ｍｉＲ￣２７ｂ
中图分类号:Ｓ８１３.２４　　　　文献标志码:Ａ　　　　文章编号:１０００－２０３０(２０１６)０２－０２４９－０６
ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ￣２７ｂａｎｄｉｔｓｔａｒｇｅｔｇｅｎｅＰＰＡＲγｉｎｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒａｎｄｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ
ＳＵＮＷｅｎｘｉｎｇ１?２?ＮＡＮＷｅｎｔｉｎｇ１?ＧＵＳｈｕｈｕａ１?ＨＡＮＨａｉｙｉｎ１?ＬＩＹａｎ１?ＣＨＵＷｅｉｗｅｉ１?ＣＨＥＮＪｉｅ１*
(１?ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ?Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５?Ｃｈｉｎａ?
２?ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ?ＮａｎｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ?Ｎａｎｔｏｎｇ２２６０１９?Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ:[Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ]Ｔｈｅａｉｍｏｆｔｈｉｓｐａｐｅｒｗａｓｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｉｐｉｄｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｐｏｒｃｉｎｅｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒａｎｄｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ?ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ￣ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｐｔｏｒｇａｍｍａ(ＰＰＡＲγ)ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｉｎｔｈｅｓｅｔｗｏｔｙｐｅｓｏｆａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ?ｔｈｅｍｉｃｒｏＲＮＡｓ(ｍｉＲＮＡｓ)ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙｔａｒｇｅｔｉｎｇＰＰＡＲγｇｅｎｅｗｅｒｅａｌｓｏｐｒｅｄｉｃｔｅｄａｎｄｖｅｒｉｆｉｅｄ.[Ｍｅｔｈｏｄｓ]ＴｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒａｎｄｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅａｓｓｅｓｓｅｄｖｉａｏｉｌｒｅｄＯｓｔａｉｎｉｎｇ.ＴｈｅｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆＰＰＡＲγｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ￣ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｍｉＲＮＡｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴ￣ＰＣＲ.ＴｈｅｔａｒｇｅｔｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｃａｎｄｉｄａｔｅｍｉＲＮＡｓａｎｄＰＰＡＲγｗａｓｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ(ｑＲＴ￣ＰＣＲ)ａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ.ＴｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｉＲＮＡｓｔａｒｇｅｔｉｎｇＰＰＡＲγｗｅｒｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ?ａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｂｙｄｕａｌ￣ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒａｓｓａｙ.[Ｒｅｓｕｌｔｓ]Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｈａｄｓｔｒｏｎｇｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙ(Ｐ&０.０５).ＢｏｔｈｍｉＲ￣１２８?ｍｉＲ￣３０１?ｍｉＲ￣２７ａａｎｄｍｉＲ￣２７ｂ?ｗｅｒｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｏｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙｔａｒｇｅｔＰＰＡＲγ.ＡｍｏｎｇｔｈｅｓｉｘｍｉＲＮＡｓ?ｍｉＲ￣２７ａａｎｄｍｉＲ￣２７ｂｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｉｎｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ(Ｐ&０.０５).Ｈｏｗｅｖｅｒ?ｄｕａｌｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｏｎｌｙｍｉＲ￣２７ｂｃｏｕｌｄｓｕｐｐｒｅｓｓＰＰＡＲγｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ(Ｐ&０.０５).[Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ]ＩｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｐｏｓｓｅｓｓｓｔｒｏｎｇｅｒｌｅｖｅｌｓｏｆＰＰＡＲγ?ａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｔｈｅｒｅａｓｏｎｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｆａｔｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒａｎｄｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｉｎｐｉｇｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ?ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ?ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ￣ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｐｔｏｒｇａｍｍａ(ＰＰＡＲγ)?ｍｉＲ￣２７ｂ收稿日期:２０１５－０５－２２
基金项目:国家自然科学基金项目(３１２７２４２３)
作者简介:孙文星?博士?*通信作者?陈杰?教授?博导?主要从事动物分子遗传育种研究?Ｅ￣ｍａｉｌ:ｊｉｅｃｈｅｎ＠ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ?ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆＰＰＡＲγｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｉｎｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ(Ｐ&０.０５).ＳｉｘｍｉＲＮＡｓ?ｍｉＲ￣１３０ａ?ｍｉＲ￣１３０ｂ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｔｈａｎｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｉｎｖｉｔｒｏ.ＷｅｉｎｆｅｒｔｈａｔｔｈｅｖａｒｉａｎｃｅｏｆｍｉＲ￣２７ｂｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｉｎｔｈｅｄｉｖｅｒｓｅ
２５０南　京　农　业　大　学　学　报第３９卷
肌内脂肪(ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｆａｔ?ＩＭＦ)含量可影响肌肉的肉色、嫩度和多汁性?是肉质指标中的关键参数[１－２]?在国内外瘦肉型猪的选育过程中?在提高瘦肉率的同时也降低了ＩＭＦ含量?现在瘦肉型猪中ＩＭＦ含量约为１.５％左右?明显低于ＩＭＦ的最适范围２％~３％?从而影响了猪肉的品质?所以?提高ＩＭＦ含量?同时不影响其他部位的脂肪沉积?甚至降低皮下脂肪与内脏脂肪的沉积?已成为家畜育种者所关注的热点?而实现这一育种目标的关键是寻找调控脂肪在机体差异沉积的机制?
过氧化物酶体增殖物激活受体γ(ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒγ?ＰＰＡＲγ)属于过氧化物酶体增殖物激活受体家族?可与类维生素Ａ受体(ＲＸＲ)形成异源二聚体?通过与靶基因上的过氧化体增殖反应元件结合来调控靶基因表达[３]?在脂肪分化沉积过程中?ＰＰＡＲγ与ＣＣＡＡＴＴ增强子结合蛋白α(ＣＣＡＡＴｅｎｈａｎｃｅｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎα?Ｃ/ＥＢＰα)通过相互正反馈调节来促进脂肪的分化与脂质的沉积?对长白猪、巴克夏猪、汉普夏猪和杜洛克猪ＰＰＡＲγ基因的ＢｓｒＩ￣ＰＣＲ￣ＲＦＬＰ进行多态性分析?发现ＰＰＡＲγ的多态性与猪肉的多汁性和嫩度显著相关?并且品种间的比较发现ＰＰＡＲγ可以显著影响猪肉的风味[４]?ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ(ｍｉＲＮＡｓ)是物种间保守的内源性表达的非编码小分子ＲＮＡ?长度２２ｎｔ左右?于１９９３年在秀丽新小杆线虫中首次被发现[５]?近年研究发现?ｍｉＲＮＡｓ在脂肪细胞分化和脂质代谢方面发挥着重抑制脂肪沉积?还发现ｍｉＲＮＡｓ与机体不同部位的脂肪沉积相关[１２]?要作用?如ｍｉＲ￣１４６ｂ[６]、ｍｉＲ￣１０３[７]、ｍｉＲ￣２１[８]等可促进脂肪沉积?而ｍｉＲ￣１３０[９]、ｍｉＲ￣１４５[１０]、ｍｉＲ￣１５５[１１]则
鉴于ＰＰＡＲγ在脂肪沉积过程中的关键作用?本研究分析了ＰＰＡＲγ在肌内脂肪细胞与皮下脂肪细胞中的差异表达?并从ｍｉＲＮＡｓ的角度解释ＰＰＡＲγ在肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞差异表达的分子机制?１　材料与方法
１.１　材料１.１.１　试验动物　３~７日龄雄性长白猪(３头)购于南京农业大学江浦农场?１.１.２　试剂　Ⅱ型胶原酶、胎牛血清(ＦＢＳ)、高糖ＤＭＥＭ培养基、ＰＢＳ液、０.２５％胰蛋白酶购自Ｇｉｂｃｏ公司?油红Ｏ购自南京生兴生物技术有限公司?双荧光酶报告基因检测试剂盒(Ｅ１９１０)购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司?Ｔｒｉｚｏｌ、ＲＮＡ反转录试剂盒(ＤＲＲ０３６Ａ)?ｍｉＲＮＡｓ反转录试剂盒(Ｄ３５０Ａ)?ＲＮＡ荧光定量试剂盒(ＲＲ４２６Ａ)?ｍｉＲＮＡｓ荧光定量试剂盒(ＲＲ７１６)均购自ＴａＫａＲａ公司?地塞米松(ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ?Ｄｅｘ)、胰岛素(ｉｎｓｕｌｉｎ?ＩＮＳ)、３－异丁基－１－甲基黄嘌呤(３￣ｉｓｏｂｕｔｙｌ￣１￣ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ?ＩＢＭＸ)购自Ｓｉｇｍａ公司?ＰＰＡＲγ一抗(ｓｃ￣７２７３)、β￣ａｃｔｉｎ一抗(ｓｃ￣４７７７８)、羊抗鼠二抗购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司?ｍｉＲ￣２７ａ、ｍｉＲ￣２７ｂ的ｍｉｍｉｃ购于上海吉玛公司?Ｘ￣ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡ(Ｃａｔ.Ｎｏ.０４４７６０９３００１)转染试剂购于Ｒｏｃｈｅ?ＰＭＳＦ(ＳＴ５０６)、ＰＩＰＡ裂解液１.２　方法(Ｐ００１３Ｂ)、ＢＳＡ蛋白浓度测定试剂盒(Ｐ００１２Ｓ)购于碧云天生物技术公司?其他试剂均为国产分析纯?１.２.１　前体脂肪细胞的获取　通过成熟脂肪细胞去分化的方法[１３]获取前体脂肪细胞?颈动脉放血处死仔猪?取背最长肌和背部皮下脂肪?经１ｇ?Ｌ－１Ⅱ型胶原酶３７℃消化３０ｍｉｎ?２００ｇ离心５ｍｉｎ?取上层脂肪细胞?将脂肪细胞接种到注满培养基的培养瓶中?倒置培养７~１０ｄ?成熟脂肪细胞发生自动去分化?获得１.２.２　前体脂肪细胞的诱导分化　待前体脂肪细胞１００％汇合后?利用“鸡尾酒法”诱导细胞分化?即用含１０％ＦＢＳ、２.５μｍｏｌ?Ｌ－１Ｄｅｘ、５μｇ?ｍＬ－１ＩＮＳ、０.１ｍｍｏｌ?Ｌ－１ＩＢＭＸ的成脂诱导液培养细胞３ｄ?用含体积分数１.２.３　反转录及荧光定量ＰＣＲ(ｑＲＴ￣ＲＣＲ)　采用Ｔｒｉｚｏｌ提取细胞总ＲＮＡ?采用ＴａＫａＲａ的反转录试剂盒(ＤＲＲ０３６Ａ)进行ＲＮＡ反转录?用ｍｉＲＮＡｓ反转录试剂盒(Ｄ３５０Ａ)进行ｍｉＲＮＡｓ反转录?具体步骤见试剂盒说明书?
采用ｑＲＴ￣ＰＣＲ对ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲγ２、脂肪组织甘油三酯水解酶(ａｄｉｐｏｓｅｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｌｉｐａｓｅ?ＡＴＧＬ)、激素敏感脂肪酶(ｈｏｒｍｏｓｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｉｐｏｓｅ?ＨＳＬ)、乙酰ＣｏＡ羧化酶(ａｃｅｔｙｌＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ?ＡＣＣ)、脂肪酸合成酶(ｆａｔｔｙａｃｉｄｓｙｎｔｈａｓｅ?ＦＡＳ)基因和ｍｉＲ￣２７ａ、ｍｉＲ￣２７ｂ、ｍｉＲ￣１３０ａ、ｍｉＲ￣１３０ｂ、ｍｉＲ￣１２８、ｍｉＲ￣３０１的表达情况进行检测(引物见表１)?ｑＲＴ￣ＲＣＲ反应体系及反应条件参照ＴａＫａＲａ的ＲＮＡ荧光定量试剂盒(ＲＲ４２６Ａ)、ｍｉＲＮＡｓ荧光定量试剂盒(ＲＲ７１６)说明书进行?对ｍＲＮＡ的检测以β￣ａｃｔｉｎ为内参?对ｍｉＲＮＡｓ的检测以与猪基因组无同源性的乱序片段Ｅ５(５′￣ＧＴＧＡＣＣＣＡＣＧＡＴＧＴＧＴＡＴＴＣＧＣ￣３′)为外参?定量数据通过２－ΔΔＣＴ法进行计算?为１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基培养细胞６ｄ?前体脂肪细胞?
第２期孙文星?等:ｍｉＲ￣２７ｂ及其靶基因ＰＰＡＲγ在肌内和皮下脂肪细胞中的差异表达分析
表１　定量引物序列
Ｔａｂｌｅ１　ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｏｒｑＲＴ￣ＰＣＲ２５１
基因名称Ｇｅｎｅｓｙｍｂｏｌ
ＰＰＡＲγＰＰＡＲγ２ＡＣＣＦＡＳＡＴＧＬＨＳＬβ￣ａｃｔｉｎｍｉＲ￣２７ａｍｉＲ￣２７ｂｍｉＲ￣１３０ａｍｉＲ￣１３０ｂｍｉＲ￣１２８ｍｉＲ￣３０１ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＮＭ＿２１４３７９ＮＭ＿２１４３７９ＮＭ＿００１１１４２６９ＮＭ＿００１０９９９３０ＮＭ＿００１０９８６０５ＮＭ＿２１４３１５ＤＱ８４５１７１ＭＩ０００２４４２ＭＩ００１３１０９ＭＩ０００８２７１ＭＩ００１３１３６ＭＩ０００２４５１ＭＩ０００２４３２引物(对)序列Ｐｒｉｍｅｒ(ｐａｉｒｓ)ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′→３′)Ｆ/Ｒ:ＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＡ/ＴＧＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧＧＣＴＴＴＡＴＦ/Ｒ:ＧＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＧＡＴＧＣ/ＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＴＧＴＦ/Ｒ:ＴＴＣＣＴＡＴＣＧＧＣＴＡＴＴＧＡＣＡ/ＣＴＴＣＧＣＡＣＡＴＡＣＡＣＣＴＣＣＦ/Ｒ:ＣＡＴＴＣＧＧＴＧＣＧＴＣＣＴＧＧＴＧ/ＡＧＧＣＧＴＧＣＴＣＣＧＴＣＴＧＣＴＴＦ/Ｒ:ＴＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡ/ＧＣＡＣＡＴＣＴＣＴＣＧＡＡＧＣＡＣＣＡＦ/Ｒ:ＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＴＧＴＣＴＴ/ＴＡＣＣＣＧＴＴＧＧＣＴＧＧＣＧＴＣＴＣＦ/Ｒ:ＴＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＣＧＣＣＴＣＴＧ/ＡＴＧＴＣＣＣＧＣＡＣＧＡＴＣＴＣＣＣＦ:ＴＴＣＡＣＡＧＴＧＧＣＴＡＡＧＴＴＣＣＧＣＦ:ＴＴＣＡＣＡＧＴＧＧＣＴＡＡＧＴＴＣＴＧＣＦ:ＣＡＧＴＧＣＡＡＴＧＴＴＡＡＡＡＧＧＧＣＡＴＦ:ＣＡＧＴＧＣＡＡＴＧＡＴＧＡＡＡＧＧＧＣＡＴＦ:ＴＣＡＣＡＧＴＧＡＡＣＣＧＧＴＣＴＣＴＴＴＦ:ＣＡＧＴＣＣＡＡＴＡＧＴＡＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣ
１.２.４　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ　利用ＲＩＰＡ蛋白裂解液裂解分化的脂肪细胞?提取总蛋白?经ＢＣＡ蛋白试剂盒测定蛋白浓度?蛋白变性后?利用ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ凝胶８０Ｖ、２ｈ进行蛋白分离?蛋白上样量为每孔２０μｇ?随后２００ｍＡ、２ｈ将蛋白转到聚偏二氟乙烯(ＰＶＤＦ)膜上?裁剪ＰＰＡＲγ、β￣ａｃｔｉｎ条带?用１％ＢＳＡ封闭１ｈ?一抗４℃１.２.５　ｍｉＲＮＡ生物信息学预测　利用在线网站ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ.ｏｒｇ/)与ＰｉｃＴａｒ(ｈｔｔｐ://ｐｉｃｔａｒ.ｍｄｃ－ｂｅｒｌｉｎ.ｄｅ/)预测靶向ＰＰＡＲγ的ｍｉＲＮＡｓ?通过网站ｍｉＲａｎｄａ(ｈｔｔｐ://ｍｉｃｒｏｒｎａ.ｓａｎｇｅｒ.ａｃ.ｕｋ/１.２.６　构建ＰＰＡＲγ基因３′￣ＵＴＲ区荧光报告载体　含有ＰＰＡＲγ基因３′￣ＵＴＲ质粒由南京农业大学动物１.２.７　ｍｉＲＮＡ靶向性验证　利用双荧光报告系统检测候选ｍｉＲＮＡｓ对ＰＰＡＲγ基因的靶向性?将ＰＫ￣１５细胞以１×１０５ｍＬ－１的密度接种到１２孔板中?用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养２４ｈ?利用Ｘ￣ｔｒｅｍｅＧＥＮＥＰｒｏｍｅｇａ双荧光检测试剂盒检测荧光活性?荧光强度以萤火虫荧光强度与海肾荧光强度的比值表示?生理生化实验室潘士锋博士赠送?质粒名为ｐＧＬ３￣Ｃｏｎｔｒｏｌ/ＰＰＡＲγ?ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ/)获取预测ｍｉＲＮＡｓ的序列?过夜?二抗室温孵育１ｈ?ＥＣＬ显色?ＣＤＤ成像系统拍照?ｓｉＲＮＡ转染试剂将ｍｉｍｉｃ(５０μｍｏｌ?Ｌ－１)或ｍｉｍｉｃ阴性对照(ＮＣ)(５０μｍｏｌ?Ｌ－１)、ｐｈＲＬ￣ＴＫ(０.０５μｇ)、ｐＧＬ３￣Ｃｏｎｔｒｏｌ/ＰＰＡＲγ(１μｇ)质粒共转染ＰＫ￣１５细胞?转染步骤参照转染试剂说明书?培养４８ｈ?利用方法如前所述[１３]?即用１０％甲醛固定细胞后?再用油红Ｏ染色１５ｍｉｎ?并通过异丙醇萃取细胞内的油１.２.８　油红Ｏ染色及脂滴含量测定　待前体脂肪细胞分化成熟后?采用油红Ｏ染色观察细胞分化情况?红Ｏ?通过油红Ｏ含量的多少反映细胞内甘油三酯含量?
?采用ＳＰＳＳ１６.０统计软件对数据进行分析?每个试验重复３次?数据用平均数±标准差(ｘ±ＳＤ)表示?１.３　数据的统计学分析
采用配对ｔ测验分析肌内和皮下前体脂肪细胞的分化能力以及基因在两种脂肪细胞中的表达差异?采用独立样本ｔ测验分析ｍｉＲＮＡｓ对荧光素酶报告基因活性的影响?
２　结果与分析
２.１　肌内前体脂肪细胞与皮下前体脂肪细胞分化能力的比较
将肌内前体脂肪细胞与皮下前体脂肪细胞经ＤＭＩ诱导分化９ｄ后?发现肌内前体脂肪细胞的分化率高于皮下脂肪细胞(图１－Ａ)?并且细胞内甘油三酯含量显著高于皮下脂肪前体细胞(Ｐ&０.０５)(图１－Ｂ)?脂肪合成关键基因ＡＣＣ与ＦＡＳ在肌内脂肪细胞中的表达量显著高于其在皮下脂肪细胞中的表达?同时脂肪分解关键基因ＡＴＧＬ与ＨＳＬ表达量也显著高于其在皮下脂肪细胞中的表达(Ｐ&０.０５)(图１－Ｃ)?由此可见?在体外?肌内前体脂肪细胞的分化能力强于皮下前体脂肪细胞?并且肌内脂肪细胞的脂质代谢能力２.２　ＰＰＡＲγ在肌内脂肪细胞与皮下脂肪细胞中的表达差异强于皮下脂肪细胞?
ｑＲＴ￣ＰＣＲ结果显示:ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲγ２在肌内脂肪细胞中的表达量显著高于其在皮下脂肪细胞中的表达量(Ｐ&０.０５)(图２－Ａ)?Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示?ＰＰＡＲγ１、ＰＰＡＲγ２蛋白在肌内脂肪细胞中的表达量显著高于其在皮下脂肪细胞中的表达量(Ｐ&０.０５)(图２－Ｂ)?
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1 方法 mir- 靶基因的预测 27 根据 mirbase 。尽管发现的比较早, 但 27 关于 mir- 的功能和靶基因的研究较少, 主要 27 见于 2009 年。.........
1)mirbase:众所周知的 microrna 基因注释数据库。目前 mirbase 只提供了 microrna 的靶标的预测软件的链接(如: pictar ) 。最新版本发布时间: 2010 年 .........
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靶基因序列结合自由能以及经验模型预测出特定 microrna的靶基因结合位点,但计算机...]。目前,已经在193个物种中发现25 214个microrna(mirbase,release19)。在植 .........
图 1 mir-10000 的靶基因与差异表达基因的 venn 图 4、tf 调控 mirna 分析 我们使用 chipbase[10]数据预测分析调控 mir-10000 的转录因子(tf)信息,然后从中.........
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建立在芯片与生物信息学预测基础上的mirna靶基因鉴定研究进展_生物学_自然科学_专业...越来越 多 , 截止 2008 年 9 月 , 登载在 sanger mirna 数据库 mirbase........
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