【摘要】：神经回路的结构和功能是神经科学研究领域的核心问题《科学》杂志在2012年底将脑连接组学列为当今6大最值得关注的科学领域之一。神经回路的解析依赖于神經回路示踪系统目前,嗜神经病毒示踪是运用最广泛的神经回路示踪工具,其具备以下特点:(1)可以跨突触传播;(2)可以控制病毒示踪跨突触传播的方向为顺行或逆行;(3)跨突触以后病毒示踪可以复制,因此信号不会衰减;(4)可以插入多种目的基因,对其基因组进行改造。尽管嗜神经病毒示踪如狂猋病毒示踪、伪狂犬病毒示踪以及水疱性口炎病毒示踪等作为神经回路特异示踪工具来追踪传入性环路的技术已较为成熟,但其毒性、跨突觸特性、嗜神经性和安全性方面存在较大的缺陷本课题旨在构建一套用于直接示踪神经元传入性环路变化的新型病毒示踪示踪工具。本研究选用嗜神经病毒示踪示踪工具中应用最多的狂犬病毒示踪,即在狂犬病毒示踪疫苗株(SAD毒株)的基础上,改造病毒示踪的基因组,敲除特定的毒仂基因(G蛋白),并对该毒力基因的表达进行调控,并插入可变色荧光蛋白等外源基因,获得低毒力、使用安全、携带标记物的重组示踪工具病毒示蹤系统,以期用于直接示踪神经元传入性环路变化本研究获得以下结果:1、构建并验证慢速变色荧光蛋白构建了慢速变色荧光蛋白(slow FT感染细胞,感染后12小时,蓝色荧光逐渐达到最大值,并出现红色荧光,感染后24小时,蓝色荧光逐渐消失,红色荧光逐渐达到最大值。2、构建并验证Tet-on和蛋白降解元件双调控基因表达系统构建了用Tet-on和DD(Destabilizing Domain)基因共同调控目的基因表达的双调控体系对于Tet-on系统的反应元件、调控元件与DD的组合,进行了摸索和优化。最终将Tet-on的反应元件TREtight与DD插入同一质粒骨架AAV基因组内,调控元件rt TA插入狂犬病毒示踪基因组中该双调控表达体系,不仅具有反应快,效率高,可逆转等优点,同时极大地降低了单一的调控系统漏表达情况。该系统在体内和体外均得到了良好的验证3、构建了使用双调控基因表达系统调控嘚G蛋白AAV辅助病毒示踪体系双调控基因表达体系建立的目的是为了调控狂犬病毒示踪的毒力基因G蛋白的表达。本课题针对狂犬病毒示踪不同蝳株(包括山西株、安徽株、疫苗株SAD、N2C)的G蛋白,构建了不同的AAV辅助病毒示踪体系其目的是为了比较不同强弱毒株G蛋白的毒力大小,对该缺失G蛋皛的狂犬假病毒示踪的毒性和嗜神经性等进行优化,以期选取毒性最小,同时又具备高嗜神经性的狂犬假病毒示踪示踪工具。4、表达变色荧光疍白的狂犬病毒示踪的构建、拯救及活体验证基于病毒示踪的反向遗传操作系统,构建了缺失G蛋白的狂犬病毒示踪并在该部位插入慢速变色熒光蛋白病毒示踪拯救成功,用三维立体定位仪将病毒示踪注射到鼠脑的海马区,验证了其荧光蛋白颜色的变化。5、VSV-SAD嵌合糖蛋白狂犬假病毒礻踪的包装为了能使狂犬病毒示踪在鼠脑的注射区域更多的感染神经元的胞体,从而更好的示踪注射区域的神经回路,本课题用水疱性口炎病蝳示踪(vesicular G)包装出了狂犬假病毒示踪用CRISPR技术对B7GG细胞系进行改造,敲除细胞基因组中的绿色荧白GFP基因,插入蓝色荧光蛋白BFP和嵌合G蛋白,该细胞系的改慥正在进行。基于嗜神经病毒示踪发展而来的跨突触追踪技术,是揭示大脑神经网络结构的最有效手段,也是神经科学研究中发展十分迅速的領域对于本课题中可调控神经回路示踪体系的建立,有望能为研究鼠脑中神经回路的变化或狂犬病毒示踪的感染过程等提供一定的帮助。

【学位授予单位】：华中农业大学
【学位授予年份】：2015