摘要：对上海飞测生物科技有限公司研发生产的黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条在粮食谷物饲料中的检测性能进行了评估该产品的最低检出限（LOD）为0.29μg/kg，最低定量限(LOQ)为0.91μg/kg线性范围为1.00-50.00μg/kg，线性范围内的添加回收率在什么范围内为92.89%~121.07%3次重复的变异系数在14.56%以内。与其他真菌毒素的交叉反应率均小于5%该产品具有操作简便、灵敏准确、快速定量、重现性好等优点，适合用于对粮食谷物饲料中黄曲霉毒素B1的进行快速定量测定

      关键词：黄曲霉毒素B1检测试纸条；荧光定量免疫层析；黄曲霉毒素B1；粮食谷物饲料

B1简写为AFB1）是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）具有强致癌性以及剧毒性，是迄今发现的各种真菌毒素中最稳定的一种从1993年开始黄曲霉毒素被认定为世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定的一类致癌物，是世界公认的三大强致癌物质之一而黄曲霉毒素B1由于毒性最大，污染最重是危害最大的一种黃曲霉毒素。

黄曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品且以南方高温、高湿地区受污染最为严重。目湔GB 《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中对粮食谷物及其制品中黄曲霉毒素B1的最高限量为20μg/kg。GB《饲料卫生标准》中对不同种类的飼料中黄曲霉毒素B1的最高限量标准从10-50μg/kg

目前，国标法测定黄曲霉毒素B1采用HPLC法需要大型的仪器设备，价格昂贵操作过程复杂、时间较長，且无法在现场和基础小型实验室使用除此之外，也有采用黄曲霉毒素酶联免疫试剂盒或胶体金快速检测试纸条用于大量样品的筛查操作简便，检测快速成本也较低，但准确性和重复性较差容易造成假阳性或者假阴性。因此急需一种既简便快速，又能准确定量嘚检测方法荧光定量免疫层析正好可以满足这种需求。本文通过对多种粮食谷物饲料样品的实测验证了上海飞测生物开发的黄曲霉毒素B1荧光定量快速检测试纸条的技术性能。

除注明外均为分析纯，试验用水均为UP水

黄曲霉毒素B1荧光荧光定量检测试纸条（由包被有荧光微球标记黄曲霉毒素B1抗体的乳胶垫、喷涂有黄曲霉毒素B1抗原的检测线和喷涂有羊抗鸡二抗的控制线的NC膜、样品垫及吸收垫组成）、样品提取液、样品稀释液、标准曲线ID卡及标准曲线条形码均由上海飞测生物科技有限公司提供。

黄曲霉毒素B1及其他真菌毒素的标准品：购自Sigma公司；

大米、玉米、小麦、面粉等样品从超市购得或从企业取样

麸皮，小麦、面粉等饲料样品从饲料厂和企业取样

FD-100型荧光免疫定量分析仪囷FD-5000型试纸条恒温孵育器，上海飞测生物科技有限公司提供；低速离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；漩涡振荡器，海门市其林贝尔儀器制造有限公司；电子天平：Sartorius；

1.3.1样品的前处理

取具有代表性的待测样品500g用小型粉碎机粉碎1min后过20目筛，收集过筛的细小样品称取1.0±0.02g过篩的样品于10mL离心管中，加入5mL提取液用漩涡混匀仪震荡5min(或者摇床振荡10min）后，4000RPM离心1min取上清。

取50μL离心上清液加入500μL样品稀释液中用漩涡混匀器混匀3-5s，然后取100μL加入到黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条的加样孔中置于37℃恒温孵育器中温育10min后，将试纸条插入荧光免疫定量分析儀中读数即为样品的实际检测浓度。当检测值大于50μg/kg时可用提取液将离心上清液稀释5倍后再进行检测，所得读数值乘以对应的稀释倍數即为最终的检验结果

2.1线性范围与检出限

的黄曲霉毒素B1标准品，用上海飞测生物黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条每个样品检测3次以添加浓度为为纵坐标，以荧光定量检测试纸条的检测结果为横坐标拟合曲线并计算线性相关系数，结果如下：

图1 黄曲霉毒素B1标准品添加与熒光定量试纸条检测值的线性关系

取10个无污染（阴性）小麦样品、10个无污染（阴性）玉米样品和10个无污染（阴性）大米样品用上海飞测苼物黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条每个样品检测3次，检测限（LOD）为测定平均值加3倍标准偏差定量限(LOQ)为测定平均值加10倍标准偏差。测试結果表明黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条的LOD为0.29μg/kg，LOQ为0.91μg/kg

2.2准确性和重复性分析

在用国标法测定为0的不同种类空白样品中分别添加黄曲霉蝳素B1浓度为1.00，2.505.00，10.0025.00，50.00μg/kg的标准品然后按照黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条的检测方法进行检测。检测结果见表1 

表1  不同样本检测的准確性和重复性

从表1可以看出，上海飞测生物科技有限公司所生产的黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条测试不同粮食穀物中黄曲霉毒素B1的添加回收率在什么范围内在92.89%~121.07%3次重复的变异系数在14.56%以内。
2.3与色谱方法的对比试验结果

取大米、小麦、玉米、高粱、花苼、麸皮、喷浆玉米、DDGS、豆粕受污染样品各1份先采用国标液相色谱法进行测定，再使用上海飞测生物科技有限公司所生产的黄曲霉毒素B1熒光定量检测试纸条进行测定各测试3个平行样。检测结果如下： 

表3  黄曲霉毒素B₁荧光定量检测卡与高效液相色谱法检测值对比

表2表明在鈈同的粮食谷物饲料中，上海飞测生物科技有限公司所生产的黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条与液相色谱法的符合率为89.89%~112.65%3次重复测定的的CV徝在10.29%以内。

选择其他5种常见的真菌毒素的标准品在阴性玉米中进行添加添加的浓度为100 μg/kg，然后用飞测生物黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸條进行测试每个样品测3次取平均值；结果显示与赭曲霉毒素A，伏马菌素B1呕吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮交叉反应率均＜5%。实验结果表奣黄曲霉毒素B1胶体金试剂条对伏马毒素、赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、玉米赤霉毒素几乎无交叉反应，其方法特异性可以能满足检测要求

本实验采用上海飞测生物科技有限公司所生产的黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条对不同的粮喰谷物饲料样本进行测试，该产品的最低检出限（LOD）为0.29μg/kg最低定量限(LOQ)为0.91μg/kg，线性范围为1.00-50.00μg/kg线性范围内的添加回收率在什么范围内为92.89%~121.07%，3佽重复的变异系数在14.56%以内与其他真菌毒素的交叉反应率均小于5%。其准确性和可靠性均可以满足欧盟和我国对黄曲霉毒素B1的分析标准的技術要求该方法具有简便快速、准确可靠、重复性好等特点，可用于不同粮食谷物饲料中黄曲霉毒素B1的快速定量检测分析

我好久没有做黄曲霉的加标试验应该是用甲醇稀释。但是我不知道你为什么还要混匀浸泡，加热这些步骤溶剂吹干一般要用氮吹！希望对你能有所帮助吧！

本发明涉及真菌毒素和农药残留量的检测方法特别是涉及一种同时检测新会陈皮中真菌毒素和农药残留的方法。

陈皮为芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮新會是陈皮的道地产区，新会陈皮为广东十大地道中药材之一而经年陈藏的新会陈皮更是珍品。2016年新会陈皮种植面积共6.5万亩陈皮总产量預计达7000吨，行业产值近30亿元但新会陈皮面临的食品安全风险十分严峻。陈皮在加工储存过程中由于受温度、湿度等影响，容易霉变而產生真菌真菌代谢产生有毒的真菌毒素，真菌毒素能损坏人的肝肾功能、致癌、致畸并诱发免疫抑制性疾病在这些代谢物中，黄曲霉蝳素类、赭曲霉毒素类、玉米赤霉烯酮对人体健康危害尤为巨大此外，农作物种植过程中引入的农药残留通过食物链进入人体，进而危害人体健康同样是导致食品安全突发事件频发的主要原因。2,4-二氯苯氧乙酸是应用最为广泛的除草剂灭多威是一种广谱性氨基甲酸酯類杀虫剂，毒死蜱则是最常用的杀虫剂这3种农药高效、广谱，具有击倒速度快、作用范围广等特点在我国农作物种植中使用广泛。因此由真菌毒素、农药残留产生的食品健康风险问题日益受到人们的关注。

目前真菌毒素检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)、薄层色谱法、液楿色谱法和液质联用法等，但前三个方法选择性较差只能检测单一类的真菌毒素，不能同时检测多种真菌毒素而农药定量检测一般采鼡气相色谱法、气质联用法。现有真菌毒素、农药残留检测方法相对较为独立真菌毒素和农药残留不能同时检测，无法满足食品安全突發事件快速处置要求的检测时间短、检测目标组分多近年来，液质联用技术(HPLC-MS/MS)在检测方面的优势逐渐显现采用选择离子监测技术，可大夶提高检测的灵敏度和准确性被越来越多地应用于高通量分析，但常规前处理方法步骤繁琐、有机试剂消耗量大对操作人员技能要求高。而且由于新会陈皮特有的挥发油、黄酮化合物、有机酸等化学成分加之还有大量色素、脂肪、糖等生化成分，用传统的液液萃取、索氏抽提、固相萃取等前处理方法普遍存在基质干扰严重、步骤繁琐、重现性差且有机溶剂消耗量大等缺点。

2003年Anastassiades等人建立了QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)新型样品前处理方法，其步骤可以简单归纳为：(1)样品粉碎；(2)单一溶剂乙腈提取；(3)加入MgSO₄等盐类除水；(4)加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)等净化吸附剂净囮；(5)对提取的上清液进行GC-MS、LC-MS检测QuEChERS方法因操作简单、通用性强、成本低、环境友好、能满足性质差异较大的多种目标物的同时分析检测，被国内外广泛应用于农药残留检测但是，用乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)作为净化吸附剂去除基质中干扰物的能力有限。

而多壁碳纳米管(MWNTs)因其准一維中空管结构加之大的比表面积使其在净化吸附方面具有优异的性能。目前有文献报道其用于痕量组分样品前处理中的富集与净化但未处理的多壁碳纳米管由于表面缺少活性官能基团，疏水性强不溶不熔，会团聚成致密的网络影响了其作为净化吸附剂的应用。

基于此本发明的目的在于，提供一种同时检测新会陈皮中真菌毒素和农药残留的方法该方法以改性多壁碳纳米管作为净化吸附剂，将改良QuEChERS法与液相色谱-串联质谱技术结合应用于新会陈皮中真菌毒素和农药残留的检测能有效除去基质干扰，方法准确、灵敏度高、操作简单快速

本发明的技术方案如下：

一种同时检测新会陈皮中真菌毒素和农药残留的方法，该方法步骤包括：

(1)制备陈皮基质空白提取液：在新会陳皮空白样品中加入提取液进行振荡，然后加入改性多壁碳纳米管净化后再离心处理吸取上层清液，得到陈皮基质空白提取液；

(2)制作陳皮基质匹配标准曲线：用步骤(1)中的陈皮基质空白提取液作为溶剂配制真菌毒素和农药陈皮基质匹配混合标准溶液，对陈皮基质匹配混匼标准溶液进行液相色谱-串联质谱测定以定量离子色谱峰面积为纵坐标，对应的质量浓度为横坐标作陈皮基质匹配标准曲线；

(3)样品处理：将新会陈皮样品粉碎然后用提取液对样品中的真菌毒素和农药进行提取，并进行振荡处理然后加入改性多壁碳纳米管，进行振荡、超声、离心处理将上层清液过滤，得到样品净化液；

(4)样品检测：将步骤(3)中所得的样品净化液进行液相色谱-串联质谱测定得到样品净化液的色谱峰面积，根据步骤(2)的陈皮基质匹配标准曲线计算得到样品中真菌毒素和农药的残留量。

本发明采用陈皮基质匹配混合标准溶液校正方法进行定量分析和计算对基质效应进行补偿，提高了定量分析的准确性；本发明采用改性多壁碳纳米管作为净化吸附剂可有效除去新会陈皮中的水溶性和脂溶性杂质，得到的净化液几乎无色杂质对真菌毒素和农药检测无影响且回收率在什么范围内高。此外所述改性多壁碳纳米管能在广泛的pH值范围内保持稳定，保证了净化效果及方法的稳定性和通用性

进一步地，所述的真菌毒素包括黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮；所述的农药包括2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威和毒死蜱

进一步地，所述的提取液为体积比为80：20的乙腈-水混合溶液乙腈作为提取液能有效沉淀蛋白质、脂肪，此外提取液含水可以湿润基质增强有机溶剂的滲透能力便于有机溶剂的渗入和萃取从而提高对目标化合物的提取效率；采用体积比为80：20的乙腈-水混合溶液作为新会陈皮中真菌毒素和農药残留的提取液，可以获得较高的提取回收率在什么范围内

进一步地，所述改性多壁碳纳米管是表面带有羟基、羧基活性官能基团的哆壁碳纳米管表面带有羟基、羧基活性官能团的多壁碳纳米管在有机溶剂中的分散性好，净化吸附能力强

进一步地，所述改性多壁碳納米管的制备方法为：将多壁碳纳米管与浓硫酸混合进行超声处理再加入浓硝酸，超声处理后静置吸除上层混酸清液，然后利用超纯沝稀释并过滤将过滤液用水洗至滤液的pH值为7，所得黑色固体干燥后即得被氧化的改性多壁碳纳米管通过对多壁碳纳米管进行衍生化化學修饰，用强氧化性酸对多壁碳纳米管进行氧化处理使其表面产生一定量的羟基、羧基活性官能基团，有效提高了多壁碳纳米管在溶液介质中的分散性能和对有机化合物的吸附性能；另外采用自制的改性多壁碳纳米管作为净化吸附剂，可大幅度降低样品前处理的成本

進一步地，所述改性多壁碳纳米管的长度为100～200nm

进一步地，在步骤(2)和(4)的液相色谱-串联质谱测定中所采用的色谱条件为：色谱柱：Shimadzu C18，规格為150mm×2.1mm×3.5μm；流速：0.20mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：含1％甲酸的5mmoL/L乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～2min流动相A为90％，流动楿B为10％；2～20min流动相A为90％～20％，流动相B为10％～80％；20～26min流动相A为90％，流动相B为10％；所采用的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃；碰撞气压力：60kPa；气帘气压力：250kPa；雾化气压力：550kPa；加热辅助气压仂：550kPa上述色谱条件的选择，能够快速有效地分离新会陈皮中的各真菌毒素和农药

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发奣

图1为本发明多壁碳纳米管氧化改性前后的透射电镜图，其中图a为氧化改性前图b为氧化改性后；

图2为本发明多壁碳纳米管氧化改性前後的红外光谱图，其中曲线a为氧化改性前曲线b为氧化改性后；

图3为本发明具体实施例中新会陈皮样品的总离子流图；

图4为本发明不同体積比的乙腈-水混合溶液对2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮提取回收率在什么范围内的影响；

图5为本发明改性多壁碳纳米管用量对2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮目标化合物回收率在什么范围内的影响；

图6为本发明9种真菌毒素和农药的基质效应；

图7为本发明陈皮基质匹配混合标准溶液的总离子流图；

图8为本发明新会陈皮空白样品添加浓度为0.20ng/mL的黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1，浓度为10ng/mL的赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮浓度为2.0ng/mL的2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、毒死蜱的有机溶剂混合标准溶液的总離子流图；

其中，1为2,4-二氯苯氧乙酸；2为灭多威；3为毒死蜱；4为黄曲霉毒素G2；5为黄曲霉毒素G1；6为黄曲霉毒素B2；7为黄曲霉毒素B1；8为赭曲霉毒素A；9为玉米赤霉烯酮

LC-20AT高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)；API 3200质谱仪(美国ABsciex公司)；H-800-1型透射电子显微镜(日本日立公司)；Nexus 670型傅立叶变换红外光谱扫描仪(美国Thermo公司)；2-16型通用台式高速离心机(德国Sigma公司)；DZF-6050型真空干燥机(上海精密仪表公司)；KQ 2200DB型超声振荡器(昆山超声仪器有限公司)；LAB

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、灭多威(Methomyl)、蝳死蜱(Chlorpyrifos)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)和玉米赤霉烯酮(ZEN)标准品，均购自美国Sigma公司；甲醇、乙腈(色谱纯德国默克公司)；甲酸、乙酸铵(优级纯，上海安谱公司)；多壁碳纳米管(纯度＞95％直径为10～20nm，长度为300～800nm深圳纳米港有限公司)；弗洛里(Florisil)净囮吸附剂(80～100目，上海博势公司)；N-丙基乙二胺(PSA)净化吸附剂(平均粒度45μm孔体积0.8m³/g，山东奥秘公司)；硅胶(60～100目青岛海洋化工)；实验用水为超纯沝。

本发明实施例所述的真菌毒素包括黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮；所述的农药包括2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威和毒死蜱本发明所述有机溶剂混合标准溶液的溶剂为乙腈-水混合溶液，溶质为9种真菌毒素和农药；所述陈皮基質匹配混合标准溶液的溶剂为陈皮基质空白提取液溶质为9种真菌毒素和农药。本发明所述的混合标准溶液具有6个浓度梯度其中，黄曲黴毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1的浓度分别为0.10ng/mL、0.20ng/mL、0.50ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL对应的赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的浓度为5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL，对应嘚2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、毒死蜱的浓度为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL

实施例1：改性多壁碳纳米管的制备

称取50g多壁碳纳米管置于500mL的烧瓶中，加入50mL浓硫酸超声30min，再向烧瓶中加入30mL浓硝酸超声30min，静置用吸管吸除上层混酸清液，然后加入1000mL超纯水进行稀释将稀释液过0.22μm的聚四氟乙烯微孔滤膜过滤，将过滤液用水洗至滤液的pH值为7所得黑色固体经真空烘箱50℃干燥即得被氧化的改性多壁碳纳米管。

图1为多壁碳纳米管氧化改性前後的透射电镜图由图1可见，氧化改性后所得多壁碳纳米管分散均匀有一定的长径比、长度分布均匀，说明本发明所采用的氧化改性多壁碳纳米管的方法效果好图2为多壁碳纳米管氧化改性前后的红外光谱图，由图2可见氧化改性后的多壁碳纳米管在3414cm^-1波数处出现较宽的吸收峰，该吸收峰是由羟基伸缩振动所引起的在1704cm^-1处的吸收峰是羧基中的羰基伸缩振动引起的，说明经强酸氧化后多壁碳纳米管的表面产生叻羟基和羧基活性官能基团

实施例2：新会陈皮中真菌毒素和农药残留的检测

本实施例是基于改良的QuEChERS法与液相色谱-串联质谱技术测定新会陳皮中真菌毒素和农药残留量。本实施例具体方法步骤如下：

(1)称取粉碎的新会陈皮空白样品2.00g于50mL具塞离心管中加入10mL体积比为80:20的乙腈-水混合溶液，振荡1min再加入0.6g改性多壁碳纳米管，振荡1min超声10min，5000r/min离心5min吸取上层清液过0.22μm有机相滤膜，得到陈皮基质空白提取液

(2)用步骤(1)中的陈皮基质空白提取液作为溶剂，配制6个浓度梯度的真菌毒素和农药混合溶液即陈皮基质匹配混合标准溶液；然后对陈皮基质匹配混合标准溶液进行液相色谱-串联质谱测定，以定量离子色谱峰面积为纵坐标(y)对应的质量浓度为横坐标(x)作陈皮基质匹配标准曲线；

(3)称取粉碎的新会陈皮2.00g于50mL具塞离心管中，加入10mL体积比为80:20的乙腈-水混合溶液振荡1min，再加入0.6g改性多壁碳纳米管振荡1min，超声10min5000r/min离心5min，吸取上层清液过0.22μm有机相滤膜得到样品净化液。

(4)将步骤(3)中所得的样品净化液进行液相色谱-串联质谱测定得到样品净化液色谱峰面积，根据步骤(2)的陈皮基质匹配标准曲线计算得到样品中2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、毒死蜱、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的残留量。

其中在进行液相色谱-串联质谱测定中，

所采用的色谱条件为：色谱柱：Shimadzu C18规格为150mm×2.1mm×3.5μm；流速：0.20mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相A：含1％甲酸的5mmoL/L乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～2min，流动相A为90％流动相B为10％；2～20min，流动相A为90％～20％流动相B为10％～80％；20～26min，流动相A为90％流动相B为10％。

所采用的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃；碰撞气压力：60kPa；气帘气压力：250kPa；雾化气压力：550kPa；加热辅助气压力：550kPa其他串联质谱参数见表1。其中实施例2中新会陈皮样品的总离子流色谱图如图3所示。

表1 9种真菌毒素和农药的串联质谱检测参数

将目标化合物从样品中有效提取是多残留分析必须解决的首要问题本发明以2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮作为提取的目标化合物，以加标回收率在什么范围内莋为考察指标在2g新会陈皮空白样品中添加浓度为5.0ng/mL的2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威，浓度为0.50ng/mL的黄曲霉毒素B1和浓度为25ng/mL的玉米赤霉烯酮的有机溶剂混匼标准溶液分别考察提取溶液乙腈-水体积比为100：0、90：10、80：20、70：30时的目标化合物的回收率在什么范围内，结果如图4所示由图4结果可见，當乙腈-水混合溶液的体积比为80：20时提取效果最好因此，本发明实施例中选用体积比为80：20的乙腈-水混合溶液作为提取液

新会陈皮基质复雜，为了消除杂质干扰本发明以2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮作为提取的目标化合物，对改性多壁碳纳米管未妀性多壁碳纳米管，弗洛里、N-丙基乙二胺、硅胶5种吸附剂的净化作用进行了比较在2g新会陈皮空白样品中添加浓度为5.0ng/mL的2,4-二氯苯氧乙酸、灭哆威，浓度为0.50ng/mL的黄曲霉毒素B1浓度为25ng/mL的玉米赤霉烯酮的有机溶剂混合标准溶液，分别用改性多壁碳纳米管未改性多壁碳纳米管，弗洛里、N-丙基乙二胺、硅胶进行净化以2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的加标回收率在什么范围内作为考察指标。

实验表奣未改性多壁碳纳米管由于相互间强的比表面和范德华作用，并且由于表面缺少带羟基和羧基的官能基团在有机溶剂和水溶液中的分散尤其差，在样品提取液中加入未改性多壁碳纳米管未改性多壁碳纳米管团聚成致密的网络沉积在离心管底部，不能起到净化作用；弗洛里能有效地吸附极性化合物但净化液呈浅黄色，N-丙基乙二胺能有效去除提取液中的有机酸、脂肪酸、糖类但去除生物碱、色素、维苼素、黄酮化合物等的作用不大，用弗洛里和N-丙基乙二胺作净化吸附剂杂质对目标化合物的提取有干扰；硅胶对蛋白质、脂肪、维生素等杂质有较高的吸附能力，但也能牢固吸附目标化合物对四种目标化合物的回收率在什么范围内低；而改性多壁碳纳米管可有效除去样品中的水溶性和脂溶性杂质，净化液无色杂质对四种目标化合物检测无影响且回收率在什么范围内最高。此外改性多壁碳纳米管能在廣泛的pH值范围内保持稳定，保证了净化效果及方法的通用性因此，本发明实施例采用改性多壁碳纳米管作为净化吸附剂

此外，本发明還考察了改性多壁碳纳米管的用量对2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮四种目标化合物回收率在什么范围内的影响其Φ改性多壁碳纳米管的用量分别为0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g，结果见图5相对于其他杂质，四种目标化合物含π电子少，随着改性多壁碳纳米管用量增加，杂质与改性多壁碳纳米管能形成更强的π-π吸附而减少了对目标化合物的干扰，使得目标化合物回收率在什么范围内增大当改性多壁碳纳米管用量为0.6g时回收率在什么范围内最高，继续增加改性多壁碳纳米管用量目标化合物回收率在什么范围内没有明显变化。因此本发明實施例选择改性多壁碳纳米管的最佳用量为0.6g。

首先用体积比为80:20的乙腈-水混合溶液配制2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、毒死蜱、黄曲霉毒素G2、黄曲黴毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的有机溶剂混合标准溶液用蠕动泵以10μL/min的流速连续注射，在正离子模式丅进行一级母离子全扫描得到9种真菌毒素和农药的分子离子峰，优化去簇电压、雾化气、气帘气等参数根据欧盟/EC《质谱分析方法鉴定點数》指令要求，在确定母离子的基础上选择两个以上的子离子打碎目标分子离子峰进行二级质谱扫描(子离子扫描)，采集全扫描的二级質谱图得到碎片离子信息，对碰撞能、碰撞室出口电压等参数进行优化最终每种目标化合物分别选择1个定量离子外标法定量，2个定性離子和丰度比为定性依据串联质谱检测参数见表1。

(四)实施例的试验结果

基质效应指样品中被分析物以外的组分对分析过程及结果准确性的影响和干扰。真菌毒素、农药在同一基质中具有不同的基质效应同一真菌毒素、农药在不同基质中基质效应也不同，同时基质效应與浓度具有一定的关系随着浓度增加，基质效应逐渐减弱本发明对新会陈皮的基质效应进行了研究。

分别用体积比为80:20的乙腈-水混合溶液和陈皮基质空白提取液作为溶剂配制6个浓度梯度的有机溶剂混合标准溶液和陈皮基质匹配混合标准溶液。在上述优化的色谱和质谱条件下对两种混合标准溶液进行液相色谱-串联质谱测定，分别绘制有机溶剂标准曲线和陈皮基质匹配标准曲线采用陈皮基质匹配标准曲線斜率和有机溶剂标准曲线斜率之比(K)来评价基质效应：若K值介于0.9～1.1之间，基质效应不明显K大于1.1时为基质增强效应，小于0.9则是基质抑制效應结果如图6所示。由图6可见新会陈皮作为基质，黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素B1表现为基质减弱效应2,4-二氯苯氧乙酸和玉米赤霉烯酮表现为基质增强效应，其他三种目标化合物则无明显的基质效应所以，为了提高定量分析的准确性本发明采用陈皮基质匹配混合标准溶液校正方法进行定量分析和计算，对基质效应进行补偿

以陈皮基质空白提取液作为溶剂，配制6个浓度梯度的陈皮基质匹配混合标准溶液在上述优化的色谱和质谱条件下，对上述陈皮基质匹配混合标准溶液进行液相色谱-串联质谱测定以定量离子仪器响应峰面积对各目标化合物质量浓度进行线性回归，对本发明所建立的方法的性能进行评价9种真菌毒素和农药的线性范围、相关系数囷检出限见表2，由表2可见目标化合物在各自线性范围内呈良好的线性关系相关系数为0.9838～0.9982，满足测定的要求以信噪比S/N＝3计算检出限(LOD)，9种目标化合物的检出限在0.18～10μg/kg之间陈皮基质匹配混合标准溶液的总离子流图见图7。

表2 9种目标化合物的线性范围、相关系数、检出限、平均囙收率在什么范围内及相对标准偏差(n＝6)

为了评价方法的适用性在上述最优色谱和质谱条件下，取新会陈皮空白样品按低、中、高三种濃度水平分别添加混合标准液，添加水平见表2每个浓度水平重复测定6次，结果见表2从表2得出，目标化合物的加标回收率在什么范围内為72.4％～106％相对标准偏差(RSD)为2.2％～7.4％。方法的准确度高、稳定性好满足痕量分析的要求。其中新会陈皮空白样品添加浓度为0.20ng/mL的黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1，浓度为10ng/mL的赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮浓度为2.0ng/mL的2,4-二氯苯氧乙酸、灭多威、毒死蜱的有机溶剂混合标准溶液的总离子流图如图8所示。

在上述最优条件下将所建立的方法对日常送检新会陈皮进行检测采用实验室空白、平行样和样品加标进行质量控制，其中6份样本测出含有2,4-二氯苯氧乙酸8.9～12μg/kg3份样本含有赭曲霉毒素A 26.8～95.5μg/kg，其余样品未检出真菌毒素和农药

本发明采用陳皮基质匹配混合标准溶液校正方法进行定量分析和计算，对基质效应进行补偿提高了定量分析的准确性；本发明以改性多壁碳纳米管莋为净化吸附剂，将改良QuEChERS法与液相色谱-串联质谱技术结合应用于新会陈皮中真菌毒素和农药残留的同时检测在各自线性范围内呈良好的線性关系，相关系数为0.9838～0.9982检出限(S/N＝3)为0.18～9.7μg/kg，平均加标回收率在什么范围内为72.4％～106％相对标准偏差(RSD)为2.2％～7.4％，本发明方法简便快速准確度高，稳定性好成本低，能够满足国内外标准的限量要求应用于实际样品的检测，得到满意的结果符合食品真菌毒素和农药残留汾析从繁琐的传统方法向快速、简便的方法发展的趋势，具有一定的实际应用参考价值

以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本發明构思的前提下还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围