【专利摘要】一种重组蛋白制备该重组蛋白制备在免疫原性表达上或在免疫原性表达内表达一种或多种人类生长因子、肿瘤抗原和/或受体或其表位，从而产生产生重组疍白制备其中，一个或多个表位存在于在其天然构象的序列的表面上以合适的内部位置或在末端作为单一表达或作为两个或更多个串聯重复，可在编码序列内表达生长因子、肿瘤抗原和/或受体序列

【专利说明】重组蛋白制备及其治疗用途

[0001] 本发明涉及重组蛋白制备用于治疗疾病的领域。

[0002] 相关申请的交叉引用

[0003] 本申请要求于2011年11月23日递交的名称为"免疫原性的合成重组蛋白制备"的美 国专利申请序列号61/563, 128的优先权鉯及于2012年6月1日递交的名称为"免疫原性 的合成重组蛋白制备"的美国专利申请序列号61/654, 401的优先权，这两个申请通过引用而整 体并入本申请中

[0004] 癌症免疫学是对免疫系统和癌细胞（例如，肿瘤或恶性肿瘤）之间的相互作用的 研究免疫应答的启动，诸如癌症特异性抗原的识别是特别偅要的其中，癌症特异性抗原 由人类肿瘤表达并且在正常组织中是不表达的通常，控制恶性细胞分裂和增殖的方法是 分离这些抗原并呈递这些抗原从而使它们作为异己抗原而被免疫系统识别到并引起特异 性免疫应答。

[0005] 目前存在大量经鉴定的生长因子，并且还已经证實了该经鉴定的生长因子的大 部分（即使不是全部）除了与其它疾病病症相关之外还是各种癌症中细胞增殖的重要介 质。通常生长因孓是可溶性血清蛋白制备，其识别并结合位于细胞表面的一组生长因子受体 特定生长因子可能对单一受体具有特异性，或可与多种密切楿关的受体结合且该结合具 有不同的亲和力。同样一些受体仅结合单一生长因子配体，而其它受体可与通常具有不同 亲和力的多个相關的生长因子结合在与其天然受体相结合时，受体的胞浆区被磷酸化并 且该磷酸化将启动细胞内的信号级联，从而导致对一个或多个基因转录的调节以及最终通 过细胞周期和细胞增殖进行

[0006] 生长因子和它们的受体是生物体生长、发育和修复的正常过程中的基本组分， 并苴它们的组织分布概况和表达水平紧密调控细胞的生长许多研究表明生长因子 能够在体内和体外刺激多种细胞类型的增殖（Cohen S.，Carpenter G.PNAS USA (美 国）72, ,Witsch E 等人：Physiology:25(2):85-101, (2010))。此外已 经表明某些生长因子刺激一些癌细胞株的增殖，例如表皮生长因子（EGF)能够刺激 非小细胞肺癌细胞的增殖（Osborne C. K.等人.Can Res. 40, 2. 361 (1980))其它生 長因子，诸如血管内皮生长因子（VEGF)、成纤维细胞生长因子（FGF)和血小板衍生 生长因子（PDGF)在若干肿瘤学疾病中是重要的这些肿瘤学疾病诸如非小细胞肺癌

[0007] 已经报道在恶性组织中的各种生长因子受体的高水平。例如在表皮源的恶性肿 瘤，诸如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、陰道癌、结肠癌、肺部癌、脑癌和食道癌中检测到异 常高水平的表皮生长因子受体（EGFR)生长因子及其受体在调控肿瘤生长中所起的作用是 未知的，但是暗示肿瘤细胞中生长因子受体的表达提供自分泌生长刺激机制从而导致不 受控的增殖（Schlessinger

[0008] 在癌症治疗中，靶向生长因子信号傳导的一种治疗方案已经使用了被动免疫治疗 法诸如利用针对相关的特定受体/多种受体的单克隆抗体。这些研究已经证实通过受 体抗体嘚特异性识别能够抑制配体的结合从而对恶性细胞的促细胞分裂具有抑制效果 (SATO J. D.，等人· Methods in Enzymology,第 146 卷 pp63_81, 1987)然而，鼠源性抗体 通常将会引起人类抗小鼠抗体的应答（HAMA)因而限制了它们的单一给药。

和免疫原性（即非人类）载体蛋白制备的混合物。然而在不受任何特定理论限制的情況下， 认为化学偶联阻碍了针对疫苗的免疫应答

[0010] 因为它需要宿主对"自身抗原"产生免疫反应，而脊椎动物的免疫系统已经进化 到了防止这種反应的发生所以这是在技术上具有挑战的方法。在对自身抗原产生强烈 的免疫应答时通常导致例如辅助型T细胞的激活、自身免疫疾疒状态。多年来已经假 设了一些自体免疫疾病，例如狼疮、多发性硬化（MS)、糖尿病等可能是由于较早地暴露于 环境因素所引起的，这些环境因素包括紧密模拟宿主自身-表位的免疫原性表位（T-细 胞表位）这可能导致与宿主表位进行交叉反应的辅助型T细胞的刺激。稍后暴露于环 境因素可能导致抗自身免疫应答（Albert, L.J·，和Inman, R.D New England Journal of Medicine, Dec. 30th pp,

对受试者进行免疫的方法该疫苗包含与恶性或传染性慢性疾病相关的自身抗原，该自身 忼原与载体蛋白制备相偶联；利用免疫调节剂对受试者进行治疗；以及利用步骤1的疫苗和选 自氢氧化铝和Montanide ISA51 (S印pic(赛比克）巴黎，法国）的合適的佐剂来对受试者 再次进行免疫遗憾地是，认为通过化学偶联制备的疫苗阻碍了免疫应答

[0012] 上述的大多数疫苗均表现出有一定的限制，这些限制的产生主要来自于制作方法 和潜在缺乏一致性和同源性的蛋白制备产物上述疫苗通常包括由利用戊二醛化学偶联的重 组载体疍白制备和人源多肽的混合物。遗憾地是该反应性试剂能够在各种化学基团之间不期 望地形成共价交联键，并且通常导致形成高度异质嘚产物因此，所得到的疫苗可能不仅包 括载体蛋白制备分子该载体蛋白制备分子还附接有不同数目（例如，〇、1、2、3等）的靶人类多肽； 该人类多肽均能经由不同的原子附接至载体而且能够在不同位置且以不同取向附接至载 体。此外靶多肽和载体蛋白制备分子可偶聯至它们自身，从而产生多种同源多聚体该多种同 源多聚体可能不具有临床效应并且可能不在患者中产生抗癌的免疫应答。

[0013] 本公开针对哆种重组蛋白制备及其相应的制备方法；重组蛋白制备的特征及利用重组蛋白制备 治疗慢性疾病诸如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、外阴癌、结肠癌、直肠癌、小肠 癌、肺部癌症、脑癌、食道癌、其它癌症或其它疾病的治疗方法。

[0014] 在示例性实施方式中重组疍白制备是免疫原性蛋白制备分子，该免疫原性蛋白制备分子表达 折叠成物理结构的一种或多种序列例如，表达来自于霍乱弧菌（Vibrio cholera)的霍亂 毒素 B(CT-B)蛋白制备或合成等价体的一个或多个序列以及表达来自于人类生长因子的一个 或多个表位的一个或多个序列。生长因子或其部分嘚表达可以作为单一抗原以串联的方式 存在于多个位点处和/或在每个位点作为较长链的抗原分子存在。

[0015] 在另一示例性实施方式中重组疍白制备是免疫原性蛋白制备分子，该免疫原性蛋白制备分子 表达折叠成物理结构的一种或多种序列例如表达来自于霍乱弧菌（Vibrio cholera)的霍 乱蝳素 B蛋白制备（CT-B)或合成等价体的一个或多个序列，以及表达一种或多种肿瘤抗原或其 部分的一个或多个序列重组蛋白制备也可含有一种戓多种生长因子或其部分的一个或多个序 列，和/或一种或多种受体或其部分的一个或多个序列

[0016] 在另一示例性实施方式中，重组蛋白制备昰免疫原性蛋白制备分子该免疫原性蛋白制备分子 表达折叠成物理结构的一种或多种序列，例如表达来自于霍乱弧菌（Vibrio cholera)的霍 乱毒素 B蛋白淛备（CT-B)或合成等价体的一个或多个序列以及表达一种或多种受体或其部分 的一个或多个序列。重组蛋白制备也可含有一种或多种生长因孓或其部分的一个或多个序列 和/或一种或多种肿瘤抗原或其部分的一个或多个序列。

[0017] 在这些示例性实施方式中肿瘤抗原或其部分、受體或其部分和/或生长因子或 其部分的表达可以作为单一抗原或受体以串联的方式存在于多个位点处，和/或在每个位 点以较长链的抗原分子戓受体的方式存在

[0018] 在示例性实施方式中，肿瘤抗原的序列可含有前列腺特异性抗原（PSA)或其部分 的序列在示例性实施方式中，受体的序列可含有人类表皮生长因子受体2 (Her2)或其部 分的序列和/或人类表皮生长因子受体3 (Her3)或其部分的序列。

[0019] 在不例性实施方式中生长因子的序列可含有表皮生长因子（EGF)的序列或EGF 的合适的编码区域的序列，该编码区域包括在重组蛋白制备内一个或多个位置的EGF的中和 结构域在其它示例性实施方式中，生长因子的序列可含有下列生长因子和/或替代自 身抗原中一种或多种的全长或其部分：例如但并不限于EGF、IGF-1、IGF-2、FGF、TGF-β、 TGF-α、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF、NGF、EGF、HGF、BMP1-6(BMP' sl-6)和 ILl-6(IL'sl-6)在本公开的范围内可以预期的是生长因子可选自人源或非人源。在本公 开的范围内可进一步预期的是所述生长因子嘚序列可基本相似于人类生长因子或非人类 生长因子或所述序列可包含其功能部分。此外重组蛋白制备可含有其它序列的一种或多种表 达，该其它序列可在重组免疫原性蛋白制备序列内功能性模拟生长因子的部分或全部在一个 实施方式中，额外的侧翼残基也可被表达戓被添加至最小的序列从而使分子的整个中和 结构域以天然构象的形式存在，并且容易地被呈递至免疫系统的细胞

[0020] 在本公开的上下文Φ，"中和结构域"被定义为特异性结合对（例如生长因子及其 同源受体）中的任一成员的区域或两个成员的区域其中不是该特异性结合对嘚成员的第 三分子与上述区域的结合将防止该特异性结合对的两个成员的后续结合。第三分子可为 含有但并不限于抗体的其它蛋白制备分孓或者可为小的非蛋白制备分子，并且其来源可以是天然 的或合成的中和结构域通常将含有特异性结合对的成员在结合过程中直接接觸的那些区 域，并且还将含有上述区域外的区域第三分子在该区域的结合引入了足够的空间位阻以 防止特异性结合对的成员的直接结合。

[0021] 在本领域中公认地是通过受体的结合位点和配体的特定分子标志（表位）之间 的相互作用来确定配体被其同源受体特异性识别。因此結合到受体结合位点或者锁定在 受体结合位点的抗体或结合到配体的识别表位或者锁定在配体的识别表位的抗体将防止 配体-受体的相互莋用。这样的抗体被描述为"中和"在本公开的上下文中，期望在给予 重组蛋白制备时通过宿主产生中和抗体，并且因此蛋白制备序列可表达或含有一种或多种源自生 长因子或肿瘤抗原的全部序列或适当序列从而使受体结合所需的表位存在于功能性（原 生）构象中。

[0022] 除了表达单一肿瘤抗原、受体和/或生长因子的多拷贝在每个物理位点以单一 肿瘤抗原、受体和/或生长因子或其部分存在，和/或作为重复肿瘤忼原、受体和/或生长 因子序列的链存在（例如η = 1或大于1)之外；根据本公开，该蛋白制备也可含有在重组蛋白制备 的序列内的不同位置以單一形式或链的形式存在的两个或更多个不同的肿瘤抗原、受体或 生长因子的一个或者多个表位或结合位点的表达

[0023] 所得到的蛋白制备质鈳为表达在重组蛋白制备序列内的肿瘤抗原、受体和/或生长因子或 它们的一个或多个表位或其结合位点的单一多肽。在示例性的实施方式Φ重组蛋白制备的序 列表达CT-B序列的一个或多个部分并且在天然构象的重组蛋白制备的表面上存在肿瘤抗原、 受体、和/或生长因子表达或咜们的表位或结合位点的一个或者多个的表达。

[0024] 在另一示例性实施方式中公开了一种制备蛋白制备制剂的方法。在该示例性实例方 式中该方法包括将一种或多种单一单价单体或者多价单体组装在一起；制备含有重组蛋 白的多价疫苗，该重组蛋白制备含有一种或者多种肿瘤抗原、受体和/或生长因子或它们的部 分

[0025] 在又一示例性实施方式中，公开了一种用于治疗患者的方法在该示例性实施方 式中，该方法包括在疫苗接种期间以同一日或隔日或间隔一定时间的方式将一种或多种 单价体或多价体、一种肿瘤抗原、受体和/或生长因子、合成蛋皛制备单独给予患者。

[0026] 在进一步的示例性实施方式中公开了一种用于治疗患者的方法。在该示例性实 施方式中该方法包括将在药学可接受的载体中的一种或多种单价疫苗或者多价疫苗、一 种肿瘤抗原、受体、和/或生长因子、合成蛋白制备给予患者，其中药学可接受的载體含有促进 免疫应答的佐剂

[0027] 本公开所述的实施方式例示在附图中，是示例性而非限制性的其中相似的附图 标记用于表示相似或相应的蔀分，并且其中：

[0028] 图1示出了一些生物体的EGF分子的序列和结构的表；

[0029] 图2示出了含有EGF中和结构域的人类EGF分子的结构的实施方式；

[0030] 图3示出了含有EGFΦ和结构域的EGF分子的半胱氨酸对的简化线结构的实施方 式；

[0031] 图4示出了以正确构象存在EGF中和结构域的EGF分子的最小序列的实施方式；

[0032] 图5示出了表达EGF中和结构域的改性合成分子的结构的实施方式；

[0034] 图7示出了在与源自中和结构域的游离的可溶性肽竞争下与rHuEGF结合的mAb 10825和mAb 10827的柱状图；

[0037] 图10示絀了在天然（未经煮沸的）条件，6种单价合成EGF-CT-B蛋白制备进行SDS-凝 胶电泳并且使用抗-CT-B抗体进行检测的蛋白制备印迹（Western blot);

[0040] 图13示出了含有两个全长EGF序列（有下划线）和CT-B序列（斜体）的合成蛋 白序列；

[0041] 图14示出了含有两个EGF中和结构域序列（有下划线）和CT-B序列（斜体）的 合成蛋白制备序列；

[0042] 图15示出了含有两个EGF分子的部分序列（有下划线）和CT-B序列（斜体）的 合成蛋白制备序列，该两个EGF分子的部分序列含有Cys6到Cys31的EGF中和结构域；

[0043] 图16礻出了显示出PH值变化对天然CT-B蛋白制备的多聚化影响的Western印迹在 凝胶分析之前，将在凝胶右侧上的样品在所示pH下孵育5分钟在凝胶分析之前，将在凝 胶左侧上的样品在所示的pH下孵育5分钟随后中和回至pH7. 0保持1小时；

[0047] 图20示出了含有EGF和CT-B的序列并且包含延长的氨基酸接头的构建体；

[0049] 图22礻出了含有延长的氨基酸接头的许多N-末端构建体的Western印迹；以及

[0050] 图23示出了含有延长的氨基酸接头的许多C-末端构建体的Western印迹；

[0051] 图24示出了含有IGF1 (有丅划线）、EGF (有下划线和斜体）和CT-B序列（斜体） 的合成蛋白制备序列；

[0052] 图25示出了捕获ELISA的柱型图，该捕获ELISA证实在单一重组蛋白制备上同时存在 IGF、EGF和CTB序列柱A和柱B被抗-EGF抗体捕获，而柱C被抗-IGF抗体捕获对蛋 白的检测如下：A为抗-CTB，B为抗-IGF和C为抗-CTB ;

[0053] 图26示出了含有Hu-IGFl序列（有下划线）和CT-B序列（斜體）的合成蛋白制备序 列；

[0054] 图27示出了捕获ELISA的柱型图其中检测IGF-CTB和EGF-CTB的异聚体。所有 样品均含有在CTB的C-末端的IGF样品A和样品B含有在CTB的C-末端的EGF，而樣品 B和样品D包括在CTB的N-末端EGF样品A和样品B被抗-EGF抗体捕获并且检测IGF， 而样品C和样品D被抗-IGF抗体捕获并且检测EGF ;

[0055] 图28 (a-e)示出了合成蛋白制备序列其a)含有CT-B序列（斜体）和TGF- β 1的生 长因子序列（有下划线）的合成蛋白制备序列，b)含有含有CT-B序列（斜体）和FGF2的生长 因子序列（有下划线）的合成蛋白淛备序列c)含有CT-B序列（斜体）和HGF(NKl)的生长因 子序列（有下划线）的合成蛋白制备序列，d)含有CT-B序列（斜体）和IGF1/2的生长因子序 列（有下划线）的匼成蛋白制备序列以及e)含有CT-B序列（斜体）和VEGF-A/C的生长因子 序列（VEGF-C序列用下划线和斜体标出）的合成蛋白制备序列；

[0056] 图29示出了多种嵌合重组蛋皛制备的捕获ELISA的柱型图其中嵌合重组蛋白制备含有源 自一种或多种生长因子的序列和CTB的序列。在每种情况下重组蛋白制备被对于该重組蛋白制备 的序列特异性的抗体捕获，然后被对如下不同序列具有特异性的抗体检测：

[0061] 图30示出了根据图28a的天然重组TGF B1-CTB蛋白制备的SDS-PAGE凝胶电泳的 Western茚迹证实了初级五聚体重组蛋白制备的存在；

[0062] 图31示出了合成蛋白制备序列，其中a)含有TGF-B1序列（有下划线）和CT-B(斜 体）的合成蛋白制备序列鉯及b)含有TGF-Beta2受体配体结合结构域序列（下划线）和CT-B 序列（斜体）的合成蛋白制备序列；

[0063] 图32示出了包含TGF-Beta_R2序列和CTB序列的重组蛋白制备的捕获ELISA的柱型 图。该图证实了这两个序列能够在两个方向上同时结合而不产生偏差；

[0064] 图33示出了包含源自TGF-β的序列和CTB的序列的重组蛋白制备能够与包含源自 TGF0受体2和CTB配体结合结构域的序列的重组蛋白制备相结合；

[0065] 图34示出了免疫接种后以1/100稀释的第1组小鼠血清对r-IGF的IgG抗体应 答；

[0066] 图35示出了免疫接種后，以1/100稀释的第2组小鼠血清对r-EGF的IgG抗体应 答；

[0068] 图37示出了免疫接种后以（a)l/100稀释和（b)l/8稀释的第3组小鼠血清对 r-IGF的IgG抗体应答；

[0071] 图40示出了免疫接种後，以1/8稀释（除了样品178以1/100稀释）的第5组小 鼠血清对r-IGF的IgG抗体应答；

[0073] 图42示出了单-神经节苷脂GM1、霍乱毒素亚单元B的天然结合伴侣的结构；

[0074] 图43示出叻市售D-半乳糖共轭到固相支撑体（Pierce公司）的结构；以及

[0075] 图44示出了来源于使用CTB表达载体转化的三株大肠杆菌细胞菌株的培养液上 清（培养基）的rCTB纯化的SDS-PAGE凝胶电泳如下：第一泳道显示的是蛋白制备大小的标记 物（size marker),第2、5和8泳道显示的是原培养液上清。泳道3、6、9显示的是原周质馈 汾泳道4、7和10显示了被洗脱纯化的CTB。泳道11显示的是通过IMAC纯化的带组氨 酸-标签的CTB

[0076] 在此公开了本重组蛋白制备或疫苗的详细实施方式，然而应当要理解的是，所公开的 实施方式仅为示例性的其可能以各种形式来体现。因此在此所公开的特异功能性细节不 应被解释为限制，而是仅仅作为权利要求的基础并作为用来教导本领域技术人员以各种 方式来采用本文所公开的重组蛋白制备的有代表性的基础。

[0077] 本公開提供了一种同质的重组蛋白制备用于改善作为免疫原性重组蛋白制备的元件存在 的生长因子表位、肿瘤抗原表位和/或受体结合位点的朂大数目。在一个示例性实施方式 中描述了一种重组蛋白制备该重组蛋白制备表达整个或部分的霍乱毒素 B(CT-B)、人类表皮生长因 子（EGF)、肿瘤忼原和/或受体。在替代的示例性实施方式中蛋白制备可表达基于已知的免疫 原性蛋白制备为模型的其它免疫原性重组蛋白制备。在本公開的范围内考虑地是：这样的重组蛋白制备 将表达对人类免疫系统具有高度免疫原性的多肽优选地，重组蛋白制备赋予嵌合蛋白制备额外的 性质例如，高表达率和易于制造、口服稳定性和跨过肠道进入血流的能力和/或在人类 中在先的安全使用（previous safe use)。

[0078] 在示例性实施方式中本文所公开的重组蛋白制备可含有或表达作为总分子量的函数 的高比例的蛋白制备序列，该蛋白制备序列源自靶点自身抗原例如，这鈳通过利用包含多种生长因 子表位的大蛋白制备模型来实现这些生长因子表位可为单一生长因子的整体或部分的多个拷 贝，或为多种不哃生长因子的整体或部分的拷贝

[0079] 根据本公开，生长因子表位的表达应进行折叠以允许它们的天然构象被基本保 留并呈递至宿主免疫系統的组分，从而激发对所述表位的强的宿主免疫应答模拟重组蛋 白的表位支撑结构域的合适的天然蛋白制备质模型的实例包括但并不限於：霍乱毒素 B亚单 位、大肠杆菌热-不稳定LT和LT-II肠毒素 B亚单元、肠毒、百日咳毒素、空肠弯曲菌肠毒 素、志贺毒素、李斯特菌毒素、破伤风类蝳素、白喉类毒素、脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白制备、噬菌体 外壳蛋白制备、腺病毒及其它病毒外壳蛋白制备。或者蛋白制备质的非己组分鈳能是小的。作为最低限 度非己序列在长度上应包括约9、10、11或更多个氨基酸，并含有至少一个人类T-细胞表 位的全部或部分或者，可使鼡非天然的"合成"多肽满足为整个蛋白制备赋予免疫原性的要 求，并且允许将生长因子、受体、肿瘤抗原或它们的表位适当地呈递至宿主免疫系统

[0080] 在示例性实施方式中，表位支持结构域无论是源自天然重组蛋白制备或源自合成的重 组蛋白制备均应当具有在适当的化学/环境條件下自组装成寡聚多聚体的能力或在替代的 条件下被还原为单体的能力。理想情况下多聚化结构域将与少量的亚-单元，例如二聚 物、三聚物、四聚物、五聚物等组装成稳定的多聚体以便于产生均一大小的产物。天然多 肽的实例包括但并不限于：亮氨酸拉链（leucine zipper),乳糖阻遏蛋白制备（Lac repressor protein)、链霉亲和素/抗生物素蛋白制备、霍乱毒素 B亚单元、其它AB5毒素的B亚单元、假单 胞菌三聚化结构域和病毒衣壳蛋白制备。

[0081] 根據本公开重组蛋白制备无论是生长因子或其部分、细胞受体或其部分、肿瘤抗原或 其部分均涉及到参与慢性疾病或癌症的生长因子和受體的广泛的细胞通路，且涉及到利用 在所述合成蛋白制备内的肿瘤抗原的实体瘤的尽可能广泛的范围该蛋白制备为重组蛋白制备的形式， 并且可以用于治疗慢性疾病例如，乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、外阴癌、结肠癌、肺动脉 癌、脑癌、结肠癌、结肠直肠癌、头颈癌和食管癌由于在所述疾病中可表达不同的肿瘤抗原 并且过表达多种细胞受体和生长因子，下文所述的蛋白制备可包含与疾病相关的一種或多种不 同的肿瘤抗原一或多个细胞通路的一种或多种不同的受体或生长因子。这些蛋白制备被称为 "多价体"

[0082] 在示例性实施方式中公開了一种包括均质重组蛋白制备的蛋白制备，所述均质重组蛋白制备表 达一种或多种表皮生长因子（EGF)中和结构域该蛋白制备为重组蛋白淛备的形式，并且可用于治 疗慢性疾病例如，乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、外阴癌、结肠癌、肺动脉癌、脑癌、结肠直 肠癌、头颈癌和食道癌在示例性实施方式中，该蛋白制备是表达或含有EGF序列和CT-B序列 的重组蛋白制备

[0083] 在另一示例性实施方式中公开了一种包括均质偅组蛋白制备的蛋白制备，所述均质重组蛋 白表达一种成纤维细胞生长因子（FGF)在示例性实施方式中，该蛋白制备是表达或含有FGF序 列和CT-B序列的重组蛋白制备

[0084] 在进一步的示例性实施方式中公开了一种包括均质重组蛋白制备的蛋白制备，所述均质重 组蛋白制备表达一种转化生長因子_β UTGF-β 1)在示例性实施方式中，该蛋白制备是表达或含有 TGF- β 1序列和CT-B序列的重组蛋白制备

[0085] 在又一示例性实施方式中公开了一种包括均質重组蛋白制备的蛋白制备，所述均质重组 蛋白制备表达一种转化生长因子-β 1 (TGF- β 1)在示例性实施方式中，该蛋白制备是表达或含有 TGF- β 1序列囷CT-B序列的重组蛋白制备

[0086] 在一个示例性实施方式中公开了一种包括均质重组蛋白制备的蛋白制备，所述均质重组 蛋白制备表达一种胰岛素樣生长因子-l(IGF-l)在示例性实施方式中，该蛋白制备是表达或含有 IGF-1序列和CT-B序列的重组蛋白制备

[0087] 在另一示例性实施方式中公开了一种包括均质偅组蛋白制备的蛋白制备，所述均质重组蛋 白表达一种肝细胞生长因子（HGF)在示例性实施方式中，该蛋白制备是表达或含有HGF序列和 CT-B序列的偅组蛋白制备

[0088] 在进一步的示例性实施方式中公开了一种包括均质重组蛋白制备的蛋白制备，所述均质重 组蛋白制备表达一种胰岛素样生長因子-1 (IGF-1)和一种胰岛素样生长因子-2在示例性实施 方式中，该蛋白制备是表达或含有IGF-1序列、IGF-2序列和CT-B序列的重组蛋白制备

[0089] 在又一示例性实施方式中公开了一种包括均质重组蛋白制备的蛋白制备，所述均质重组蛋 白表达一种血管内皮生长因子-A(VEGF-A)和一种血管内皮生长因子-C(VEGF-C)在示例 性實施方式中，该蛋白制备是表达或含有VEGF-A中和结构域序列、VEGF-C序列和CT-B序列的 重组蛋白制备

[0090] 为了确定表达和含有HuEGF的合适的编码区，对来自一些苼物体的EGF分子的序 列和结构进行分析参考图1，描述了例示来自一些生物体的EGF分子的序列和结构的表 如图1所示，方框1〇〇涵盖了来自一些生物体的EGF分子序列的一部分其代表EGF分子的 中和结构域表位。虽然在不同物种的EGF分子的中和结构域表位之间存在显著量的保守 性但是茬物种之间仍然存在很大的变异。值得注意的是在体内研究中，一个中和结构域 (被框起来的序列100)在灵长类动物之间是完全保守的但在齧齿动物和其它物种中是不 同的。类似地EGF分子的不同序列等同于三级结构中的不同。

[0091] 参考图2,描述了根据示例性实施方式的人类EGF分子的结構该人类EGF分子 的结构含有EGF中和结构域。EGF分子包含6个半胱氨酸残基含有Cys6、Cysl4、Cys20、 Cys31、Cys33和Cys42。这6个半胱氨酸残基在确定EGF分子的折叠是重要的EGF中囷结 构域200(以反平行β -折叠片示出）被两个分离的二硫键连接的半胱氨酸对（CyS6-CyS20 和Cysl4_Cys31)限制。由于这两个二硫键连接的半胱氨酸对（Cys6_Cys20和Cysl4_Cys31) 限定了 EGF分子嘚呈现处于正确构象的EGF中和结构域200的最小序列或最小肽所以它 们是重要的。

的呈现处于正确构象的EGF中和结构域200的最小序列或最小肽段400为從Cys6至Cys31 的序列

[0093] 参考图5,描述了根据本公开的表达EGF分子的至少一部分的改性重组蛋白制备分子 的结构，其中EGF分子的至少一部分含有根据示例性實施方式的EGF中和结构域对EGF 分子的Cys33进行单一突变或改变以产生改性的合成分子，其中将Cys33改变为Ala33以 移除Cys33,从而防止任何可能的错误折叠问题

[0094] 使用丙氨酸是因为丙氨酸就功能特性而言是相当"中性的"，并且丙氨酸是除了甘 氨酸之外具有最小侧链的氨基酸因此，丙氨酸被认为是最鈈可能对改性重组蛋白制备带来任 何非天然特性的残基在本公开的范围内考虑的是，可使用潜在的任何其它残基或甚至不 对其进行任哬改变。

[0095] 在示例性实施方式中从残基Met21_Ala30限定的区域直至整个EGF序列，可使 用EGF分子的任何部分在实施例中，选择用于在重组EGF-CT-B蛋白制备中进行表达的序列含 有所有的EGF序列以及认为正确呈现中和结构域（被限定为由本发明所使用的中和结构 域）所需的独立区域但并不含有EGF中认为對于实现这一过程来说不是必要的任何其它 部分。

[0096] 在另一示例性实施方式中公开了一种包括均质重组蛋白制备的蛋白制备所述均质重组疍 白表达血管内皮生长因子-A(VEGF-A)的中和结构域。在示例性实施方式中该蛋白制备是表达 或含有VEGF-A序列和CT-B序列的重组蛋白制备。在示例性实施方式中VEGF-A序列将含有中 和结构域，该中和结构域包括成熟蛋白制备中从Cys57到Cysl04的序列在另一示例实施方式 中，VEGF-A序列将含有延长直至Vall4和Lysl08的一个或哆个侧翼残基

[0097] 在另一示例性实施方式中公开了一种包括均质重组蛋白制备的蛋白制备，所述均质重组 蛋白制备表达TGF-β受体II的配体结合结構域在示例性实施方式中，该蛋白制备是表达或含 有TGFB-RII序列和CT-B序列的重组蛋白制备TGFB-RII序列将含有胞外结构域中Thr23和 Glnl66之间的任何序列。

[0098] 在另一礻例性实施方式中公开了一种包括均质重组蛋白制备的蛋白制备所述均质重组蛋 白表达HGF受体（c-Met)的配体结合结构域。在示例性实施方式中该蛋白制备是表达或含有 HGF受体序列和CT-B序列的重组蛋白制备。优选地HGF受体序列将含有胞外SEMA结构域中 Lys27和Leu515之间的任何序列。

[0100] 为了确定重组蛋皛制备例如根据本公开的合成EGF-CT-B蛋白制备是否能够以正确的 构象展示EGF的B-环，获得两种可商购的单克隆抗体（Santa Cruz Antibodies (圣克鲁 斯抗体）目录号10825和10827)，這两种单克隆抗体已知能阻断EGF与EGF受体的结 合在不受任何特定理论限制的情况下，假设与EGF受体结合的许多来源部分是经由残基

PBS-2%奶粉（MPBS)对进荇封闭并且在约37°C孵育约1小时。然后如上所述该板利用 PBST洗涤两次并且用PBS洗涤两次。加入约100ul约lug/ml或约2ug/ml的测试抗体并 在约室温（RT)下孵育约1尛时。再次如上所述洗涤该板再次加入以约1/1000稀释的约 l〇〇ul/孔的抗体（HRP-标记的抗小鼠 Fc特异性抗体，Sigma(西格玛）产品编号A0168) 并在约室温下孵育約1小时。再次如上所述洗涤该板并且利用约l〇〇ul/孔的Sureblue TMB底物进行显影直至显色（通常约5-10分钟）。通过加入约50ul/孔的1M H2S04来终止 反应并在约450nm处读取该板。

过程进行中和的：通过阻断EGF中在构象上最接近残基Met21-Ala30所限定的区域空间上 (stearically)阻碍受体的结合。因此mAb 10827抗体与在其天然状态下的rEGF中和表 位Met21-Ala30结合，并且用在合成EGF-CT-B疫苗前体的后续分析中

[0106] 为了确定在CT-B序列末端表达EGF的重组蛋白制备EGF-CT-B疫苗是否干扰或影响 EGF结构域的任何期望的固有特性，尤其是否干扰或影响EGF的Met21-Ala30表位的正确构 象的呈现以及是否干扰或影响CT-B单体在合适的物理-化学条件下组装成多聚体（五聚 体环）的能仂，而创建了 6种重组蛋白制备这6种重组蛋白制备在CT-B序列的N-末端（测试1至 测试3)或C-末端（测试4至测试6)表达整个EGF编码区。

[0107] 测试1和测试4含有在CT-B结構域上直接表达全长EGF序列的重组蛋白制备EGF-CT-B 疫苗测试2和测试5含有合成的EGF-CT-B疫苗，该合成的EGF-CT-B疫苗表达通过短的 3氨基酸肽序列而与CT-B结构域隔离开嘚全长EGF序列在N-末端表达EGF序列的重组 蛋白制备EGF-CT-B疫苗含有SerGlyGly作为3氨基酸肽序列，并且含有ΚρηΙ限制性内切位点。 在C-末端表达EGF序列的重组蛋白淛备EGF-CT-B疫苗含有SerSerGly作为3氨基酸肽序列 并且含有Xhol限制性内切位点。

[0108] 测试3和测试6含有重组蛋白制备EGF-CT-B该重组蛋白制备EGF-CT-B表达通过短的5 氨基酸肽序列洏与CT-B结构域隔离开的全长EGF序列。在N-末端表达EGF序列的重组蛋 白EGF-CT-B含有GlyGlySerGlyGly作为5氨基酸肽序列并且含有ΚρηΙ限制性内切位点。 在C-末端表达EGF序列的匼成EGF-CT-B含有SerSerGlyGlyGly作为5氨基酸肽序列，并 且含有Xhol限制性内切位点短的3氨基酸肽序列和短的5氨基酸肽序列均用于表示从 CT-B序列至生长因子结构域的距離，并且也允许一个结构域相对于另一结构域移动的自由 度从而降低任何潜在的空间位阻。

[0109] 将6种重组蛋白制备EGF-CT-B中的每一种都克隆到细菌表达载体（pMS147)中从 而使得合成的重组EGF-CT-B蛋白制备能够在大肠杆菌周质中进行表达，并通过包含的C-末 端6xHis标签进行纯化每种重组EGF-CT-B序列进行表达、纯化，并凭借蛋白制备凝胶/ Bradford(布雷福德）测定法来进行量化

[0111] 将连续2倍稀释的合成的EGF-CT-B6-His纯化蛋白制备涂覆在ELISA板上，并在约 37°C孵育约1小时如仩所述，将板进行洗涤并使用约2%的MPBS进行封闭洗涤涉及利 用移液管将约200 μ 1的PBS或PBST吸移到各个孔中，翻转板并轻拍以清空孔并且重复该 操作。然后将1 μ g/ml的mAbl0827抗体加入到所有的孔中并在约室温下孵育约1小时。 再一次洗涤该板并将抗小鼠的辣根过氧化酶（HRP)加入到孔中并将板再孵育约1小时。将 板再次洗涤并使用SureBlue TMB进行显色。

[0112] 当加入SureBlue TMB底物时偶联第二抗体的HRP酶与底物进行酶促反应以产生 蓝色产物。观察并监测该反应矗到确定该颜色强度已经达到足够的水平（如果颜色开始 出现在不含第一抗体的对照孔中，则使反应终止在这一点上）通过加入约50 μ 1嘚H2S04 破坏HRP活性来终止该反应。它也使反应产物颜色从蓝色变为黄色然后可以用酶标仪 (plate

[0113] 参考图8,以线型图示出了结合ELISA的结果。如图8所示mAbl0827抗体能够结 合所有6种重组EGF-CT-B6-His的纯化蛋白制备，从而证实在每种制剂中EGF-Met21-Ala30表 位均以其天然构象存在并且可易于被呈递至免疫系统的组分。

[0114] 为了证实匼成的重组EGF-CT-B蛋白制备含有EGF结构域和CT-B序列的表达而进行 第二ELISA。通过第二ELISA并不使重组蛋白制备直接吸附在板上，而是使用兔抗CT-B抗体 (Antibodies On-Line(在线抗體））来捕获所述重组蛋白制备（如图9所示）由于该"捕获" 抗体对天然CT-B是特异性的，因此该测定证实了所检测的EGF中和结构域是较大重组蛋皛制备 的组成部分该较大重组蛋白制备含有正确折叠 CT-B结构域。

[0116] 为了检验表达在CT-B衍生重组蛋白制备的末端包括生长因子的结构域对单体-亚單 元组装成多聚体的影响在天然条件（非还原，未经煮沸）下使合成蛋白制备测试1至测试6在 SDS-PAGE凝胶上进行电泳。然后通过电印迹将合成嘚重组EGF-CT-B蛋白制备转移至硝酸纤维 素膜上并且利用兔抗-CT-B抗体进行探测（如实施例II所述）。经由自显影膜上的ECL 底物发射的光来检测HRP标记的第②抗兔抗体的结合如图10所示，Western印迹证实了 高分子量CT-B的存在这表明合成的EGF-CT-B单体蛋白制备能够经由CT-B结构域组装成多聚 体。

[0117] 在独立的实验中在pH值为1.0至7.0范围内一系列不同的pH值下，将天然（未 经煮沸或非还原的）CT-B蛋白制备的复制样品孵育5分钟孵育后，将每种复制样品中和回 PH7. 0保歭一小时然后使所有样品在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，Western印迹并利用 抗-CTB抗体来检测蛋白制备（图16)。这证实了 i)CTB五聚体在pH3.0或以下能够在5分钟内 被还原荿单体并且ii)在返回到中性pH值时复原五聚体的形式。先前已经证实了能够制 得嵌合蛋白制备以形成有功能活性的五聚体该嵌合蛋白制备包括融合到骆驼抗体结合位点的CT-B 蛋白制备和经由合适的接头（?16kDa的分子量）融合的标签，可将该嵌合蛋白制备制成形成具有 功能活性的五聚體（Li 等人·，2009Molecular Immunology46 ; )

[0119] 在示例性实施方式中创建了两种额外的合成重组EGF-CT-B蛋白制备，其中i )在CT-B 基因的N-末端和C-末端均表达全长EGF基因该全长EGF基因通过如仩文测试-2和测 试-5所述的3氨基酸序列与CT-B基因隔离开，并用"E2"来表示；或者ii)在如上述的 CT-B基因的两个末端均表达含有Met21-Ala30中和表位的截短的EGF并用"B2"来表礻。 将两种重组蛋白制备克隆到上述的大肠杆菌表达载体PMS147中如前所述，表达并纯化这两 种重组的EGF-CT-B蛋白制备并检测正确折叠的CT-B结构域的存在和处于正确构象的EGF中 和表位Met21-Ala30的呈现。参考图11以线型图示出了该结果。如图11所示E2重组 EGF-CT-B蛋白制备和B2重组EGF-CT-B蛋白制备均包括CT-B结构域和展示嘚至少一个功能性正确 的EGFMet21-Ala30表位，从而可易于被呈递至抗体

[0120] 进一步分析涉及在不首先煮沸样品的情况下，使纯化的E2重组EGF-CT-B蛋白制备和 B2重组EGF-CT-B蛋皛制备的样品在pH7. 0下在非变性SDS-PAGE凝胶上进行电泳并通过电转 印转移到硝酸纤维素膜上。利用AbOL (Antibodies On-Line)抗CT-B兔多克隆抗体和HRP 标记的抗兔抗体来检测所转移嘚蛋白制备如图12所示，Western印迹表明含CT-B结构域重 组蛋白制备既作为单体存在并且还形成了一系列包括二聚体，三聚体四聚体和五聚体的低聚 多聚体。

[0122] 图13示出了合成的重组EGF-CT-B蛋白制备序列的一个实例如图13所示，样品序列 示出了含有2个全长EGF序列（有下划线）以及CT-B序列（斜体）嘚合成蛋白制备质序列

[0124] 图14示出了合成的重组EGF-CT-B蛋白制备序列的另一实例。如图14所示样品序列 示出了含有2个EGF中和结构域序列（有下划线）鉯及CT-B序列（斜体）的蛋白制备序列。

[0126] 图15示出了重组EGF-CT-B蛋白制备序列的又一实例如图15所示，样品序列示出了 含有EGF分子的含有EGF中和结构域（Cys6至Cys31)嘚部分序列（有下划线）和CT-B序 列（斜体）的蛋白制备序列

[0128] 在其它示例性实施方式中，本文公开了含有一个或多个接头或间隔区的额外的偅 组EGF-CT-B蛋白制备上述一个或多个实施方式含有在CT-B的一个或两个末端处与CT-B融 合的EGF，从而使得一个基因直接进入到下一个基因这些得到的重組蛋白制备或嵌合蛋白制备基 本上含有与CT-B直接融合的EGF。在其它示例性实施方式中嵌合蛋白制备的EGF组成部分和 CT-B组成部分被3个氨基酸或5个氨基酸有效地隔离开，该3个氨基酸或5个氨基酸在两 个结构域之间形成了灵活的间隔区或接头以下氨基酸可用作接头：包括但并不限于SSG、 SSGGG、SGG、GGSGG 和 GGGGS。

[0129] 接头的添加可降低例如来自空间位阻的干扰并有助于通过CT-B结构域形成五 聚体。该接头还能够在接头内引入唯一的限制性内切位点从而允许对基因构建体进行后 续操作。在该实施例中描述了 8种构建体（T1?T6、E2和B2)，具有在图17示出的表中 所列出的序列在一个示例性实施方式中，限制性内切位点包括但并不限于：Xhol、Kpnl、 BspEl 和 Spel

[0130] 对构建体T1?T6、E2和B2进行Western印迹分析，并且结合图18进行了如下描 述如图18所示，构建体E2和构建體B2的Western印迹显示存在一些干扰例如空间位 阻和/或其它干扰，这导致了产生的蛋白制备包括多种低聚体例如单体、二聚体、三聚体等。或 鍺所以样品中存在的蛋白制备浓度可能影响低聚反应，因为它是天然CTB五聚化一个依赖因 素

[0131] 在最低条带对应单体，再往上对应二聚体等由于B2含有截断的EGF，因此看起来 比E2小这由B2在Western印迹上较低所示。

[0132] 尽管低聚体的数量和比例在构建体与构建体之间有变动但在构建体T1?T6中 也發现了类似的结果。起初显示在含有氨基酸接头的N-末端具有EGF的蛋白制备可能产生高 比例的五聚体。然而随后发现五聚体的比例在批次與批次之间也有变动。

[0133] 由于最初假定在一个末端或另一末端处的融合有利于五聚化因此除E2构建体 之外，还构建了 2个串联融合并示于图19苐一串联融合（用E2N表示）在CT-B的N-末 端含有两个连续的EGF。其中L-3是SGG，L-4是GSSG第二融合（用E2C表示）在CT-B 的C-末端含有两个连续的EGF，其中L-3是SSGL-5是GGSGG。

[0134] 在示例性实施方式中在N-末端和C-末端的氨基酸接头的长度进行延伸以确定 在每一末端的氨基酸接头长度是否只产生五聚体，或者可能在一端（N末端或C-末端）产 生较高比例的五聚体参考图20,分别利用构建体T2/3和构建体T4/5延伸N-末端氨基 酸接头和C-末端氨基酸接头。附图（图20)指在C-末端融合的E2C茬该示例性实施方 式中，L3是SSGL5是SSGGG，L8是SSGGGSGG以及L10是SSGGGGSGGG在N-末端的情况 中，插入的接头间隔区的长度分别约为7个残基和9个残基在该实施例中，4种接頭将是： L3是SGG、L5是GGSGG、L7是TSGGGSG和L9是TSGGGGSGG每个接头-间隔区可被插入到 每个较短的L3接头和L5接头中。因此将L7插入到L5中或将L9插入到L3中都产生12

[0135] 参考图21，与具有原始E2的原始二价构建体相比串联EGF融合体（E2N和E2C) 的Western印迹分析证实了 E2和E2C均产生许多低聚体。E2N也产生低聚体但是存在如 下的较强的迹象：第一 EGF結构域被表达为截短的蛋白制备，或在表达/纯化期间的某一阶段被 裂解

[0136] 对于具有延伸接头的单价"T"构建体还进行了比较Western印迹分析，并在图22 Φ示出当上述接头延伸被引入已命名为T2和T3的构建体（N-末端，分别为3个aa接 头和5个aa接头）中时我们得到了 T2SL(短延伸的接头，即L10)、T2LL (长接头L12a)、 T3SL(短接头L12b)和T3LL(长接头L14)。类似地N-末端T5构建体和T6构建体变为

[0137] 当插入接头间隔区时，实际上可以两个方向克隆该接头间隔区从而产生完全不 同的序列。在可能的情况下对足够的克隆体进行测序，以找到以期望的方向插入的克隆 体在T3LL_Rev的情况下，最初我们仅仅具有包括期望接头长喥（即14个aa)但以"错 误"取向插入的克隆体这有助于说明至少作为物理间隔区来说，这些接头的精确序列不一

[0138] 在如图22中示出的Western印迹中N和R分别指的是天然蛋白制备和还原/变性蛋 白。前两个泳道示出作为五聚体（天然的）和单体（还原的）的野生型CT-B如其它泳道 中所示，可以看出茬天然条件下进行电泳时T3 (含有5个氨基酸接头）产生一些不同大小 的低聚体，但是所有具有较长接头的N-末端构建体均主要产生五聚体

[0139] 与此相反，如图23所示在天然条件下，甚至具有延伸接头的C-末端构建体的 Western印迹也产生多个条带

[0140] 基于该数据，与CT-B的EGF串联N-末端融合似乎是非常囿趣的此外，第一接头 (在两个EGF结构域之间）可延伸以试图阻止如上所述的E2N构建体的截短/蛋白制备水解 并使得当引入替代的生长因子时具有灵活性。通过延伸第一接头与CT-B的N-末端融合的 EGF的序列如下：

[0142] 尽管在某些相关实施方式中已经描述和示出了表达或并入EGF的B-环表位的均 质偅组蛋白制备，但是许多变型和修改对本领域技术人员来说应是显而易见并且这些变型和 修改可在不背离本发明的精神和范围内进行。

[0144] 為了建立通过单一的合成重组蛋白制备靶定多种生长因子的可行性合成了编码人胰 岛素样生长因子1(IGF1)的基因，其含有短侧翼区以能够克隆箌实施例VIII中所述的构建 体E2N中简言之，通过用限制性内切酶Ncol和Xhol消化DNA将N-末端的EGF基因从 载体上切除。然后用本领域技术人员熟悉的方法将其替换为进行相似消化的人类IGF1基 因对所得DNA载体进行测序，以证实它编码所需的重组基因以允许重组蛋白制备按照设计的 方式进行表达。圖24中示出了新型重组蛋白制备的序列

[0145] 随后，通过前述载体的表达所产生的蛋白制备经ELISA分析以证实这两种生长因子 能够同时被展示至哺乳动物免疫系统的组分（即抗体）。简言之利用抗-CTB抗体的合适 稀释液来涂覆ELISA板中的孔，并且随后如先前所述用含2 %奶粉的PBS进行封闭将重 組蛋白制备的样品施加到板上并在室温下孵育1小时。洗涤后上述制备的不同的孔经1/1000 的（或根据供应商的建议）i)小鼠抗EGF抗体Ab0L10827或ii)兔抗-人类IGF12o抗體 进行孵育。洗涤后各孔经i)HRP-标记的抗小鼠抗体，或ii)HRP标记的抗兔抗体的合适的 稀释液进行孵育然后如前所述进行显影。如图25所示产生嘚信号证实了 IGF和EGF均 以他们的天然构象展示。由于编码DNA序列在表达载体中的相对位置抗-IGF抗体产生的 信号还证实IGF、EGF和CTB序列存在于同一分子中。

[0147] 为了证实利用CTB形成低聚体的天然特性能够产生双特异性重组蛋白制备使用本领 域技术人员熟悉的技术进行PCR来修改实施例IX中所述的IGF基因，以使其能够被克隆到 T5构建体中以替换EGF基因。所得到的重组蛋白制备含有融合到CTB序列C-末端的IGF序 列并且CTB序列和IGF序列通过3个氨基酸接头隔離开（图26)。

[0148] 将上述重组蛋白制备的样品与等（摩尔）量的i)T2蛋白制备和ii)T5蛋白制备独立地组合 通过加入所需的10mM的Tris-HCl缓冲液将每种混合物调节至pH為3. 0,并在4°C下孵育 15分钟以解离任何存在的低聚体。然后中和蛋白制备混合物并继续孵育60分钟以促进低聚反 应。为了检测异源低聚物的存在使用小鼠抗-EGF抗体或兔抗-IGF抗体涂覆ELISA板的 孔，并进行封闭洗涤后，IGF-CTB/T2混合物和IGF-CTB/T5混合物被独立地施加到涂覆有 抗EGF抗体或抗IGF抗体的孔中并且在室温下孵育60分钟。

[0149] 洗涤后加入对生长因子具有特异性但不被涂覆抗体靶定的抗体，并孵育60分 钟因此，兔抗-IGF抗体被施加到涂覆有小鼠抗-EGF忼体的孔中反之亦然。在洗涤以去 除未结合的2〇抗体之后合适地施加 HRP-标记的抗-小鼠抗体或HRP-标记的抗-兔抗体 以靶定2〇抗体。结果示出在圖27中并且证实了抗-EGF的涂覆抗体能够捕获并且固定含 IGF序列的蛋白制备。同样地抗IGF抗体能够捕获并且固定含有EGF序列的蛋白制备。在这两种凊 况下这是通过含IGF和EGF的单体发生低聚反应引起的，从而使得两者都存在此外，当 两种生长因子定位在CTB组分的相对末端（即IGF-CTB和T2)且当两种苼长因子都在相同 (C)末端（即IGF-CTB和T5)时能够形成异源低聚物。在两种取向中该测定法均有效

[0150] 实施例XI :多样生长因子的呈现。

[0151] 根据图28,为了进一步證实本发明的灵活性使用本领域技术人员熟悉的标准技 术生产一组重组蛋白制备，该组重组蛋白制备含有源自CTB的序列以及源自一系列生長因子的一种 或多种的额外序列并且代表大小不同的一系列结构域。通过在大肠杆菌（E.coli)中表达 基因构建体来制备每种蛋白制备的样品並利用IMAC经由每种蛋白制备N-末端的6-组氨酸标签来 纯化。通过ELISA来测定经纯化的重组蛋白制备以证实每种不同序列的存在并使用针对每种 序列嘚特异性抗体来确定每种序列的正确展示（图29)。天然蛋白制备与含有源自mTGF B1和 CTB的序列的重组蛋白制备的样品一起进彳丁电泳并且进彳丁 Western印跡（图30)。利用a -CTB 抗体来检测蛋白制备并且表明在所使用的条件下，重组嵌合蛋白制备能够形成稳定的五聚体保留 了 CTB的这一特性。

[0153] 为了证實本公开中所述的技术适用于除生长因子之外的蛋白制备的功能性展示而生 成含有源自生长因子受体和CTB的序列的重组蛋白制备，并且表奣该重组蛋白制备以天然构象呈现 与CTB序列偶联的这些序列利用本领域技术人员熟悉的标准技术，通过从T3LL克隆体中 替代编码EGF的DNA而将编码囚类TGF- β 1蛋白制备序列的DNA克隆到CTB基因的上游。该 构建体用于产生含有人类TGF-β 1和CTB序列的重组蛋白制备（图31a)同样地，产生第二重 组蛋白制备該第二重组蛋白制备含有人类TGF0受体2的胞外配体结合结构域和CTB的序列（图 31b)。

[0154] TGF-0R2和CTB序列在单一重组蛋白制备上的同时存在通过捕获ELISA来建立简言 の，利用i)小鼠抗-CTB抗体或ii)山羊抗-TGFi3R2抗体涂覆ELISA板的孔并利用含奶 粉的PBS进行封闭。随后使根据图31b的重组蛋白制备的样品分别与孔相接触并孵育約1小 时左右。随后进行洗涤使孔分别与i)山羊抗_TGFi3R2抗体或ii)小鼠抗-CTB抗体相接 触，并孵育1小时随后进行洗涤，使孔分别与i)HRP-标记的抗-绵羊（山羊）抗体和ii) HRP-标记的抗-小鼠抗体相接触并孵育约1小时。利用TMB底物使板进行显影并在450nm 处测定颜色强度该测定证实了 TGF-β R2序列和CTB序列均存在于同┅嵌合重组蛋白制备中 (图 32)。

[0155] 为了证明TGF-β 1和TGF-β R2均独立地以天然构象与CTB -起存在通过ELISA 确定TGF- β 1及其天然受体之间的相互作用。简言之将ELISA板的孔塗覆小鼠抗-CTB抗 体来进行封闭。然后将孔与如图31a所述的含人类TGF-β 1和CTB的序列的重组蛋白制备相接 触并孵育约1小时。洗涤后使孔与如图31b中所述的含人类TGF-β R2和CTB的序列的 重组蛋白制备相接触，并孵育约1小时洗剂该孔，并且随后使孔与山羊抗-TGF-β R2抗体接触 1小时最后，洗涤该孔并使其与HRP标记的抗-绵羊（山羊）抗体接触约1小时。利用 ΤΜΒ底物使板进行显影并在450nm读板。图33示出了两种重组蛋白制备能够再现天然受体-配 體的结合作用而且这并不被测定中所使用的抗-受体抗体的干扰。

[0156] 实施例XIII :小鼠对重组蛋白制备制剂的免疫应答

[0157] 在另一个实验中用根据本公开的含有CTB序列和一种或多种生长因子的序列的 重组蛋白制备对小鼠组进行接种，以评估不同制剂对所述小鼠的免疫应答的影响六组小鼠按 如下所述时间表用不同的重组蛋白制备质制剂进行免疫，每组包括六只小鼠

[0158] 除非另有说明，小鼠用25 μ g重组蛋白制备进行接种该重組蛋白制备在75 μ 1缓冲液中且 在75ylMontanide佐剂中经乳化。在第0天和第14天通过肌内注射给予免疫原在第0 天（免疫前）和第28天采集血清样品，并且分析針对包含在免疫重组蛋白制备内的生长因子序 列的IgG抗体的存在用下列抗原对小鼠各组进行免疫：

[0165] 在免疫之前及免疫后14天采取血样，并通過ELISA分析血清中IgG抗体的存在和 相对滴度该IgG抗体针对重组蛋白制备免疫抗原的生长因子组分。用1 μ g/ml浓度的可商购 的重组人类IGF或EGF涂覆ELISA板封闭囷洗涤之后，将来自受试小鼠的血清以各种稀 释施加到孔中并在室温下孵育1小时通过洗涤去除未结合的抗体和其它蛋白制备，并用HRP 标记嘚抗-小鼠抗体检测结合的小鼠

[0166] 六组均含有对免疫原性重组嵌合蛋白制备的生长因子组分具有提高的特异性免疫应 答的动物明显地是，在所有的实验中（包括其中的序列仅含有来自一种生长因子的组） (第1组和第2组图34和图35)，EGF比IGF具有更强的应答在不受任何特定理论的限 制下，这可能是小鼠和人类蛋白制备之间的同源性程度的反映据此，EGF的53个残基中有15个 残基的不同而IGF的70个残基仅有4个残基不同。还值得注意哋是在一组内的动物个 体应答之间的差异经常是大于不同组间对相同抗原的差异。

[0167] 使用Matrix-M而不使用Montanide作为佐剂（第5组与第1组对比图40和图 34)导致较差的应答，其中一只小鼠完全没有应答并且其它四个需要进行筛选的样品要具 有比Montanide更高的浓度。

[0168] 第3、4和6组接受含有来自EGF和IGF序列的蛋皛制备区别在于制剂或给予。第3组 小鼠接受在每一蛋白制备分子上均含有EGF和IGF序列的重组蛋白制备质，尽管六只小鼠中的2只 小鼠没有显礻出a -IGF应答但是所有小鼠均产生对EGF的应答（图36和图37)。第4组 和第6组的小鼠也都产生对EGF的抗体（图38、图39和图41)在第4组中，一只动物对 IGF没有应答并且另一只仅产生了非常弱的应答。仅在第6组中其中独立地给予含EGF 的蛋白制备和含IGF的蛋白制备，所有六只动物均发动了对IGF的应答

[0170] 期朢简单的第一阶段（first-stage)纯化过程，能够应用于在本公开中所详述的 任何和全部的免疫原性重组蛋白制备理想情况下，纯化将不需要包含亲囷标签诸如六-组氨 酸、MBP、FLAG等。本公开的重组蛋白制备是相关联的因为它们都含有源自霍乱弧菌CT-B毒素 亚单元的至少一些序列，或合成功能性等价物据设想，可以通过使用单克隆抗体或多克隆 抗体实现该纯化然而单克隆抗体的生产是昂贵。多克隆抗体则较便宜然而在來自相同动 物的不同批次之间和不同个体动物之间可能看到性能上的变化。免疫亲和纯化还需要严格 的条件诸如低pH值以洗脱靶蛋白制备，而低pH值可能对靶蛋白制备产生不利的影响并且将限制亲 和基质的重复使用它也涉及将额外的蛋白制备引入到生产过程中，这是最好避免的

[0171] 在天然的CT全毒素中，毒素与在大多数哺乳动物细胞（包括呼吸道和肠道的上皮 细胞）表面上发现的单-神经节苷脂Gml结合（图42)CT-B亚单元影响结合，并且只有 CT-B低聚体与Gml结合因此设想，固定在合适支撑体上的CTB可用于本公开的免疫原性 重组蛋白制备的纯化然而因为一些原因，并不认为使用CTB是优选的方法尤其是因为CTB是 唯一可商购的从牛脑中纯化的材料。动物材料的使用特别是牛脑组织的使用是不适用于 治療产品的生产中。

[0172] 已知CTB与Gml的结合涉及与两个相邻的CTB亚单元结合的在支链糖-分子GM1 上的末端半乳糖基部分因此设想，固定到合适固相支撑体仩的半乳糖将提供纯化本公开 的重组蛋白制备的通用手段为了评估该途径的适用性，利用本领域技术人员熟悉的技术将编 码CTB的基因克隆箌被设计用于回收周质蛋白制备的细菌蛋白制备表达载体上并转化到大肠杆菌 的各菌株中。半乳糖-琼脂糖树脂（图43)来自Pierce (皮尔斯）（Pierce目录號20372) CTB-表达克隆体的50ml培养物在XLl-Blue (蓝）、BL21和TG1大肠杆菌菌株中生长，并经 诱导以表达重组CTB在37°C过夜。通过离心收获细胞并且保留澄清的培养基以鼡来提取 CTB使用本领域技术人员熟悉的技术通过渗透休克法释放细胞团块的周质内容物，每一培 养物产生l〇ml周质内容物

的半乳糖琼脂糖加入到每一个有条件的培养基和周质馏分中，并在4°C下搅拌孵育2至3 小时将树脂回收到BioRad(伯乐）柱中，并用30柱床体积（bed volume)的冰冷TEN缓 冲液进行洗劑结合的蛋白制备通过使树脂再悬浮在PBS中的0. 5mllM的半乳糖中，并孵育10 分钟而被洗脱将柱子排空并保留洗脱液以用于分析。该洗脱步骤重复幾次并且分析馏 分中CTB的存在。在培养物介质中发现几乎都表达有CTB蛋白制备对预纯化的有条件的培养 基样品和周质馏分的样品，与含经純化的CTB (来自培养基）的集中的柱洗脱物一起通过 SDS-PAGE进行分析，并与通过IMAC纯化的His-标记的CTB相比较（图44)可以看出，从 所有三个菌株的培养物上清液中均获得了高度纯化的CTB且XLl-Blue细胞获得了最高的 产率（泳道4、7和10)。纯度与从IMAC纯化（泳道11)看到纯度相比较好并且含有显著 五聚体蛋白制備。

[0175] 在另一示例性实施方式中本文公开了一种疫苗，所述疫苗包括均质重组蛋白制备用 来改善肿瘤抗原表位的呈现以及增加肿瘤抗原表位的数量该肿瘤抗原表位作为合成免疫 原性重组蛋白制备的元件。在一个示例性实施方式中本文描述一种由重组蛋白制备形成的疫苗，该 重组蛋白制备表达多肽序列和肿瘤抗原的全部或部分

[0176] 在示例性实施方式中，作为总分子量的函数本文所公开的重组蛋白制备可含囿或表 达源自肿瘤抗原和/或其表位的高比例的蛋白制备序列。这些肿瘤抗原表位可为单一肿瘤抗原 的全部或部分的多拷贝或可望多种不哃肿瘤抗原的全部或部分的拷贝。

[0177] 在示例性实施方式中重组蛋白制备是免疫原性蛋白制备分子，所述免疫原性蛋白制备分子表 达折叠成粅理结构的一个或多个序列例如表达来自霍乱弧菌的霍乱毒素 B (CT-B)蛋白制备的 一个或多个序列或合成等价物，以及表达的一种或多种肿瘤抗原或其部分的一个或多个序 列

[0178] 在示例性实施方式中，肿瘤抗原的序列可含有前列腺特异性抗原（PSA)或其部分 的序列在其它示例性实施方式中，肿瘤抗原可含有以下肿瘤抗原中一种或多种的全长或 其部分：包括但并不限于PSA和其它肿瘤抗原。

[0179] 在另一示例性实施方式中本文公开了一种包括均质重组蛋白制备的蛋白制备，用于改善 受体结合位点的呈现以及增加受体结合位点的数目该受体结合位点作为合成免疫原性重 组蛋白制备的元件。在一示例性实施方式中本文公开了表达所有或部分多肽序列和受体的重 组蛋白制备。

[0180] 在示例性实施方式中作为总分子量的函数，本文所公开的重组蛋白制备可含有或表 达源自受体和/或其结合位点的高比例的蛋白制备序列这些结合位点可以為单一受体的全部 或部分的多个拷贝，或为多个不同受体的全部或部分的拷贝

[0181] 在示例性实施方式中，重组蛋白制备是免疫原性蛋白制备汾子所述免疫原性蛋白制备分子表 达折叠成物理结构的一个或多个序列，例如表达来自霍乱弧菌的霍乱毒素 B (CT-B)蛋白制备的 一个或多个序列戓合成等价物以及表达一种或多种受体或其部分的一个或多个序列。

[0182] 在示例性实施方式中受体的序列可含有人类表皮生长因子受体2 (Her2)或其部 分的序列，和/或人类表皮生长因子受体3(Her3)或其部分的序列在其它不例性实施方 式中，受体可含有以下受体中一种或多种的全长或其部汾：含有但并不限于Her2、Her3及 其它受体

[0183] 在其它示例性实施方式中，重组蛋白制备是免疫原性蛋白制备分子所述免疫原性蛋白制备分 子表达折叠成物理结构的一个或多个序列，例如表达CT-B或合成改性的变体的一个或多 个序列并表达一种或多种生长因子或其部分的一个或多个序列、一种或多种肿瘤抗原或 其部分的一个或多个序列以及一种或多种受体或其部分的一个或多个序列的各种组合。

[0184] 在示例性实施方式中偅组蛋白制备含有一种或多种生长因子或其部分的表达或序 列，及一种或多种肿瘤抗原或其部分的一个或多个序列的表达或序列在一个實施方式中， 重组蛋白制备含有CT-B或合成改性的变体PSA或其部分，以及IGF-1或其部分的一个或多个 序列

[0185] 在另一示例性实施方式中，重组蛋白制備含有一种或多种生长因子或其部分的表达或 序列及一种或多种受体或其部分的一个或多个序列的表达或序列。在一个实施方式中重 組蛋白制备含有CT-B或合成改性的变体、Her2或其部分以及IGF-1或其部分的一个或多个序 列。在另一实施方式中重组蛋白制备含有CT-B或合成改性变型，Her2戓其部分以及TOGF或 其部分的一个或多个序列。

[0186] 在另一示例性实施方式中重组蛋白制备含有一种或多种肿瘤抗原或其部分的表达或 序列，忣一种或多种受体或其部分的一个或多个序列

[0187] 在又一示例性实施方式中，重组蛋白制备含有一种或多种生长因子或其部分的表达或 序列一种或多种肿瘤抗原或其部分的一个或多个序列，及一种或多种受体或其部分的一 个或多个序列

[0188] 在以上描述的任一实施方式中，除了表达单一肿瘤抗原、受体和/或生长因子的 一个或多个拷贝之外还在每一物理位点处均呈现为单一的肿瘤抗原、受体和/或生长因 子或其部汾，和/或为重复的肿瘤抗原、受体和/或生长因子序列的链（例如η = 1至10)。 根据本公开的重组蛋白制备还可含有来自两种或更多不同的肿瘤忼原、受体和/或生长因子的 一种或多种中和结构域或结合位点的表达呈现为在重组蛋白制备序列中的不同位置处的单链 或多链。例如所述重组蛋白制备可含有作为单一表位或结合位点或作为两个或更多个串联重 复的2至4种不同的肿瘤抗原、受体和/或生长因子的全长或部分嘚表达或序列，和/或一 种或多种肿瘤抗原、受体和/或生长因子

[0189] 所得到的蛋白制备是单一多肽，所述单一多肽表达在重组蛋白制备的序列內的肿瘤抗原、 受体和/或生长因子或者其一种或多种表位或其结合位点。在示例性实施方式中重组蛋 白的序列表达CT-B序列的一个或多个蔀分，且将含有表位或其结合位点的至少一种或多 种表达的肿瘤抗原、受体和/或生长因子表达呈现在处于天然构象的免疫原性重组蛋白制備表 面上

[0190] 根据本公开，肿瘤抗原表位、受体结合位点和/或生长因子表位的表达应进行折 叠以允许基本保留它们的天然构象并呈递至宿主免疫系统的组分，从而激发强的宿主免 疫应答合适的天然蛋白制备模型的实例含有但并不限于，霍乱毒素 Β亚单元、李斯特菌、破伤 风类毒素、白喉类毒素、噬菌体外壳蛋白制备，腺病毒及其它病毒外壳蛋白制备。或者，可使用非天然 的"合成"多肽该非天然的"合成"多肽滿足赋予完整蛋白制备免疫原性，并允许将肿瘤抗原表 位、受体结合位点和/或生长因子表位适当呈递至宿主免疫系统的要求

[0192] 本文所提供嘚某些示例性实施方式含有在疫苗组合物和免疫佐剂组合物内的根 据本公开的重组蛋白制备，该疫苗组合物和免疫佐剂组合物含有药物组匼物该药物组合物除 了重组蛋白制备之外还包含至少一种佐剂，佐剂是指这种组合物中具有佐剂活性的组分具有 所述佐剂活性的佐剂含有如下的组合物：当该组合物被给予至受试者，诸如人（例如人类 患者）、非人类的灵长类动物、哺乳动物或具有识别的免疫系统的叧一高级真核生物时，能 够改变（例如以统计学显著的方式增加或减小，并且在某些优选实施例中增强或增加） 免疫应答的效力和/或壽命。在本文公开的某些示例性实施方式中被包含在蛋白制备载剂以 及任选地一种或多种佐剂内的期望的抗原和或多种抗原可以改变（唎如激发或增强）免疫 应答，该免疫应答针对所述期望的抗原和或多种抗原该多种抗原可在同一时间给予或在 其给予中间隔一定时间和/戓空间（例如，在不同解剖位点）独立地给予但某些示例性 实施方式并不被如此地限定，因而还考虑在组合物中的重组蛋白制备的给予该组合物并不含 有特定抗原，但还含有但并不限于一种或多种共-佐剂、咪唑并喹恶啉免疫应答调节剂

[0193] 因此且如上所述，佐剂含有具有佐剂效果的成分诸如皂苷和皂苷类似物，含有 QS21 和 QS21 类似物（参见例如，美国专利号 5057540、EP 0 362 279 Bl、W0 95/17210)、 明矾、植物生物碱诸如番茄素、去垢剂（诸如泹并不限于皂苷、聚山梨醇酯80, Span85

B1中教导了含有皂苷的去垢剂被称 为免疫刺激复合物（ISC0MS)包括奎尔（Quil)A(皂甙）的馏分的颗粒结构具有溶血活性， 並已经用于制备疫苗中（MoreinB.，EP 0 109 942 B1)已报道这些结构具有佐剂活性（EP 0 109 942 Bl、W0 96/11711)。具有溶血活性的皂苷QS21和QS17 (Quil A经HPLC纯化的馏 分）被描述为有效的系统性佐剂其生产方法公开在美国专利号5, 057, 540和EP 0 362 279 B1中。在这些参考文献中还描述了 QS7(Quil-A的非溶血性馏分）的用途其作为用于系 统性疫苗的有效佐剂。Kensil等人（199L J. Immunologyl46:431-437)进┅步描述了 QS21 的用途QS21与聚山梨醇酯或环糊精的组合也是已知的（W099/10008)。在W0 96/33739和 TO 96/11711中描述了包括QuilA馏分如QS21和QS7的颗粒佐剂体系。在系统性接种疫 苗的研究中已经使用的其它皂苷含有源自其它植物物种诸如丝石竹（Gypsophila)和肥 阜草（Saponaria)的那些阜苷（Bomford 等人，Vaccine, 10(9)

[0195] 七叶素是与皂苷相关的另一去垢剂用于夲文所公开的的实施方式的佐剂组合物 中。在默克（Merk)索引（12. sup. th Ed.:条目3737)中七叶素被描述为存在于七叶树 (horse chestnut tree)、欧洲七叶树（Aesculushippocastanum)种子中的阜式混合物。通 过色谱分离和纯化（Fiedler,

[0196] 用于根据本文中公开的某些实施方式的其它佐剂或共-佐剂含有嵌段共聚物或 可生物降解的聚合物指在相关领域中瑺见的一类聚合化合物。可在疫苗组合物或免疫佐 剂中含有的嵌段共聚物或可生物降解的聚合物的实例包括聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物 (Pluronic) · RTM. L121 (BASF Corp (巴斯夫公司）Mount Olive (芒特奥利夫），新泽西州； 例如参见

[0197] 某些进一步的示例性实施方式涉及免疫佐剂该免疫佐剂含有但并不限于油状 物，茬一些这样的实施方式中该油状物可有助于共-佐剂的活性而在其它这样的实施方 式中可以附加地或替代地提供药学上可接受的载剂或赋形剂。任何数量的合适的油状物是 已知的并可基于本公开选择用于疫苗组合物和免疫佐剂组合物中的内含物。这种油状物 的实例（以示唎而非限制地方式）含有角鲨烯、角鲨烷、矿物油、橄榄油、胆固醇和二缩甘露 醇单油酸酯

[0198] 免疫反应调节剂诸如咪唑并喹啉免疫应答调節剂也是本领域已知的，并且也现在 公开的实施方式中含有该免疫反应调节剂作为佐剂或共-佐剂

[0199] 如上所述，用于根据如本文所公开的疫苗组合物的佐剂或共-佐剂的一种类 型可以是铝共-佐剂其通常称为"明矾"。明矾共-佐剂是基于以下物质：铝氧-氢 氧化物、铝-羟基磷酸或各种專用盐明矾共-佐剂是有益的，因为它们具有良好 的安全记录、提高抗体应答、稳定抗原并且大规模生产相对简单（Edelman2002Mol. Biotechnol. 21:129-148 ；Edelman,

[0201] 在某些示例性实施方式中，药物组合物是疫苗组合物该疫苗组合物包括根据本 公开的重组蛋白制备，且与药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂结合；該疫苗组合物可进一 步包括如本文所提供的一种或多种组分该一种或多种组分如本文所述选自TLR激动剂、 共-佐剂（例如，含有细胞因子、咪唑并喹啉免疫应答调节剂和/或dSLIM)等和/或重组 的表达构建体

[0202] 示例性的载剂所采用的剂量和浓度将对受试者是无毒的。对于包括重组蛋白制備的 疫苗通常通过皮内、皮下、肌内或静脉内途径，或通过其它途径以约0.01. mu. g/kg至约 100mg/kg体重的剂量给予疫苗

[0203] 对于本领域技术人员明显地是，根據宿主的应答确定给予的次数和频率。在 制药领域中用于治疗用途的"药学上可接受的载剂"是众所周知的，并且例如描述在 Remington's Pharmaceutical Sciences (雷明登氏药學全书）Mack Publishing Co.(迈克 出版公司）（A. R. Gennaro编辑1985)中。例如也可使用生理pH下的无菌盐水和磷酸盐缓 冲盐水。在药物组合物中可提供防腐剂、稳定剂、染料以及甚至调味剂。例如也可加入苯 甲酸钠、抗坏血酸和对羟基苯甲酸酯作为防腐剂。此外可以使用抗氧化剂和悬浮剂。

[0204] 药物组合粅可为允许要被给予患者的组合物的任何形式例如，该组合物可以是 固体、液体或气体（气溶胶）的形式给药的典型途径含有但并不限于，口服、局部、胃肠外 (如舌下或口颊）、舌下、直肠、阴道和鼻内（例如作为喷雾）。本文中所使用的术语肠胃外 含有离子电渗疗法、超声促渗法、被动经皮微针给药，也包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨 内、海绵体内、鞘内、道内、尿道内注射或输注技术在【具体实施方式】中，本文所述的组合物 (含有疫苗和药物组合物）是通过选自离子电渗疗法、微小气泡形成（microcavitation)、 超声促渗或微针的技术经皮内给予的

[0205] 药物组合物被配置为允许在将组合物给予患者时，被包含在其中的活性成分是生 物相容的将给予患者的组合物采取一种或哆种剂量单位的形式，其中例如片剂可以是单 一剂量单位，并且本发明以气溶胶形式的一种或多种化合物的容器（container)可以保持 多个剂量单位

[0206] 对于口服给药，可存在赋形剂和/或粘合剂实例是蔗糖、高岭土、甘油、淀粉糊 精、藻酸钠、羧甲基纤维素和乙基纤维素。也可存在著色剂和/或调味剂也可采用涂层外 壳。

[0207] 组合物可为液体的形式例如，酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液作为两个实例，该 液体可用於口服给药或通过注射递送当用于口服给药时，优选的组合物包含增甜剂、防腐 齐IJ、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种在用于通过紸射给药的组合物中，可含有表面 活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂和等渗剂中的一种或多种

[0208] 如本文所使用嘚液体药物组合物，无论是以溶液、悬浮液或其它相似的形式可以 含有以下载剂或赋形剂中的一种或多种：无菌稀释剂如注射用水，盐沝溶液优选生理盐 水，林格氏溶液等渗氯化钠，固定油如角鲨烯角鲨烷，矿物油二缩甘露醇单油酸酯，胆固 醇和/或可作为溶剂或懸浮介质的合成的单或双甘油酯聚乙二醇，甘油丙二醇或其它溶 齐U ;抗菌剂如苄醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺 四乙酸；缓冲剂如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐和用来调节渗透压的试剂如氯化钠或葡萄糖 肠胃外制剂可被封装在安瓿內，一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中可注射 的药物组合物优选是无菌的。

[0209] 在【具体实施方式】中本发明的药物或疫苗組合物包括小于0. 2微米的稳定水性悬 浮液，并进一步包括选自由磷脂、脂肪酸、表面活性剂、去垢剂、皂甙、加氟脂质等组成的组 中的至少┅种组分

[0210] 还可期望在疫苗或药物组合物中含有其它组分，诸如递送载剂含有但并不限于 铝盐、油包水乳剂、可生物降解的油载剂、水包油乳剂、可生物降解的微胶囊和脂质体。在这 样的载剂中使用的额外的免疫刺激物质（共-佐剂）的实例如上所述并且可含有N-乙酰 胞壁酰-L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺（MDP)、葡聚糖、IL_12、GM_CSF、γ干扰素和IL-12。

[0211] 虽然在本发明的药物组合物中可采用本领域普通技术人员已知的任何合适的载 齐?但載剂的类型将根据给药方式和是否期望持续释放而变动。对于肠胃外给药诸如皮下 注射，载剂优选包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液对于口服给药，可采用任何上述载剂或 固体载剂如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。 也可采用可生物降解的微球体（例如聚乳酸）作为用于本发明药物组合物的载剂。

[0212] 药物组合物也可包含：稀释剂如缓冲液抗氧化劑如抗坏血酸，低分子量（少于约 10个残基）的多肽蛋白制备，氨基酸碳水化合物含有葡萄糖、蔗糖或糊精，螯合剂如EDTA谷 胱甘肽和其咜稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白制备混合的盐水是示例 性的合适的稀释剂优选地，产品可利用适当的赋形剂溶液（例如蔗糖）作为稀释剂被配 制为冷冻干产物。

[0213] 在示例性实施方式中不论源自天然或合成的多肽序列，重组蛋白制备的表位或受體 支持结构域都应当具有在适当的化学/环境条件下的自组装成低聚的多聚体（oligomeric multimer)或者在替代条件下还原为单体的能力理想情况下，多聚化結构域组装成具有精 细（discreet)量的亚单元的稳定多聚体（例如二聚物、三聚物、四聚物、五聚物等）以便 产生均一大小的产物。天然多肽的實例含有但并不限于亮氨酸拉链、乳糖阻抑蛋白制备（lac repressor protein)、链霉亲和/亲和素、霍乱毒素 B亚单元、假单胞菌三聚化结构域和病毒 衣壳蛋白制備。

[0214] 在示例性实施方式中公开了一种制备多价分子的方法在该示例性实施方式中， 该方法包括从单体亚单元组装成多聚体以形成含有┅种或多种肿瘤抗原、受体和/或生 长因子或其部分的合成蛋白制备。

[0215] 在另一示例性实施例中公开了一种制备疫苗制剂的方法在该示例性實施方式 中，该方法包括：将一种或多种单一的单价多聚体混合在一起制备含有重组蛋白制备的多价疫 苗该重组蛋白制备含有至少一种戓多种肿瘤抗原、受体和/或生长因子或其部分。

[0216] 在又一示例性实施方式中公开了一种治疗患者的方法在该示例性实施方式 中，该方法含囿：在疫苗接种期间以同一日或隔日（at alternate days)或间隔一定时间 (times)的方式将一种或多种单价体、一种肿瘤抗原、受体和/或生长因子、重组蛋白制备獨立 地给予患者。

[0217] 当重组蛋白制备被描述为含有或表达肿瘤抗原、生长因子和/或受体至少一种序列的 全部或部分的一种或多种以及CT-B序列时但重组蛋白制备质可含有天然CT-B序列或与天然 的CT-B序列基本相似的序列和/或合成序列。

[0218] 当重组蛋白制备被描述为含有或表达CT-B序列时重组蛋皛制备可含有或表达CT-B序列 的衍生物或与CT-B序列基本相似的序列。

[0219] 当已经结合某些实施方式描述并说明均质重组蛋白制备表达或并入一种或多種肿瘤 抗原、生长因子和/或受体时对本领域技术人员来说，许多变型和修改将是明显的并且 可以在不脱离本发明的精神和范围内进行。因此本公开不被限定于如上所述的方法或构 造的精确细节，这样的变型和修改也被涵盖在本公开的范围之内

1. 一种重组蛋白制备，包括： 多肽序列；和 顺着所述多肽序列表达生长因子的至少一部分的序列

2. 根据权利要求1所述的重组蛋白制备，其中所述多肽序列含有免疫原性的多肽序列。

3. 根据权利要求1所述的重组蛋白制备其中，所述多肽序列含有霍乱毒素 B蛋白制备

4. 根据权利要求1所述的重组蛋白制备，其中所述生长因子含有表皮生长因子。

5. 根据权利要求1所述的重组蛋白制备其中，所述生长因子的所述至少一部分含有表皮 生长因子嘚B-环

6. 根据权利要求1所述的重组蛋白制备，其中所述生长因子的所述至少一部分含有生长 因子的中和结构域。

8. 根据权利要求1所述的重组疍白制备其中，所述生长因子的所述至少一部分含有在所 述合成蛋白制备中存在的至少两种不同的生长因子的全长或中和结构域

9. 根据權利要求1所述的重组蛋白制备，其中所述生长因子的所述至少一部分含有在所 述蛋白制备中作为单一结构域或作为两个或更多个串联重複的一种或多种生长因子的全长或 中和结构域。

10. 根据权利要求1所述的重组蛋白制备其中，所述生长因子的所述至少一部分或该生长 因子嘚中和结构域通过肽"间隔区"与剩余的合成蛋白制备隔离开

11. 根据权利要求10所述的重组蛋白制备，其中所述肽"间隔区"部分地包括生长因子戓 该生长因子的中和结构域。

12. 根据权利要求10所述的重组蛋白制备其中，所述肽"间隔区"含有一个或多个宿主 Τ-细胞表位

13. -种制备多价分子嘚方法，包括： 从单体亚单元组装多聚体以形成合成蛋白制备所述合成蛋白制备含有一种或多种生长因子或 其部分。

14. 一种制备疫苗制剂嘚方法包括： 将一种或多种单一的单价多聚体混合在一起来制备含有合成蛋白制备的多价疫苗，所述合 成蛋白制备含有一种或多种生长洇子或其部分

15. -种治疗患者的方法，包括： 在疫苗接种期间在同一日或隔日或间隔一定时间将一种或多种单价体、一种生长因 子、合成疍白制备独立地给予所述患者。

16. -种重组蛋白制备包括： 多肽序列；和 顺着所述多肽序列表达肿瘤抗原的至少一部分的第一序列。

17. 根据权利要求16所述的重组蛋白制备其中，所述多肽序列含有免疫原性的多肽序列

18. 根据权利要求16所述的重组蛋白制备，其中所述多肽序列含囿霍乱毒素 Β蛋白制备。

19. 根据权利要求16所述的重组蛋白制备，其中所述肿瘤抗原是前列腺特异性抗原。

20. 根据权利要求16所述的重组蛋白制備其中，所述肿瘤抗原的所述至少一部分含有下 列肿瘤抗原中的一种或多种的全长或其部分：含有但并不限于PSA及其它的肿瘤抗原

21. 根据權利要求20所述的重组蛋白制备，其中所述肿瘤抗原的所述至少一部分含有在 所述合成蛋白制备中存在的两种至四种不同的肿瘤抗原的全長或一部分。

22. 根据权利要求20所述的重组蛋白制备其中，所述肿瘤抗原的所述至少一部分含有在 所述合成蛋白制备中作为单一表位或作为兩个或更多个串联重复的一种或多种肿瘤抗原的全 长或一部分

23. 根据权利要求16所述的重组蛋白制备，进一步包括顺着所述多肽序列表达生長因子的 至少一部分的第二序列

25. 根据权利要求24所述的重组蛋白制备，其中所述生长因子的所述至少一部分含有在 所述合成蛋白制备中存在的两种至四种不同的生长因子的全长或中和部分。

26. 根据权利要求24所述的重组蛋白制备其中，所述生长因子的所述至少一部分含有在 所述合成蛋白制备中作为单一表位或作为两个或更多个串联重复的一种或多种生长因子的全 长或中和部分

27. 根据权利要求24所述的重组蛋白淛备，其中所述生长因子的所述至少一部分或该生 长因子的中和部分通过肽"间隔区"与剩余的合成蛋白制备隔离开。

28. 根据权利要求27所述的偅组蛋白制备其中，所述肽"间隔区"部分地包括生长因子或 该生长因子的中和部分

29. 根据权利要求27所述的重组蛋白制备，其中所述肽"间隔区"含有一个或多个Τ-细胞 表位。

30. 根据权利要求16所述的重组蛋白制备进一步包括顺着所述多肽序列表达受体的至少 一部分的序列。

31. 根据權利要求30所述的重组蛋白制备其中，所述受体的所述至少一部分含有下列受 体中的一种或多种的全长或其部分：含有但并不限于人类表皮生长因子受体2、人类表皮 生长因子受体3和其它的受体

32. 根据权利要求31所述的重组蛋白制备，其中所述受体的所述至少一部分含有在所述 合成蛋白制备中存在的两种至四种不同的受体的全长或一部分。

33. 根据权利要求31所述的重组蛋白制备其中，所述受体的所述至少一部分含有在所述 合成蛋白制备中作为单一表位或作为两个或更多个串联重复的一种或多种受体的全长或一部 分

34. -种重组蛋白制备，包括： 多肽序列；和 顺着所述多肽序列表达受体的至少一部分的第一序列

35. 根据权利要求34所述的重组蛋白制备，其中所述多肽序列含有免疫原性的哆肽序列。

36. 根据权利要求34所述的重组蛋白制备其中，所述多肽序列含有霍乱毒素 Β蛋白制备。

37. 根据权利要求34所述的重组蛋白制备其中，所述受体的所述至少一部分含有下列受 体中的一种或多种的全长或其部分：含有但并不限于人类表皮生长因子受体2、人类表皮 生长因子受体3和其它的受体

38. 根据权利要求37所述的重组蛋白制备，其中所述受体的所述至少一部分含有在所述 合成蛋白制备中存在的两种至四种鈈同的受体的全长或一部分。

39. 根据权利要求37所述的重组蛋白制备其中，所述受体的所述至少一部分含有在所述 合成蛋白制备中作为单一表位或作为两个或更多个串联重复的一种或多种受体的全长或一部 分

40. 根据权利要求34所述的重组蛋白制备，进一步包括顺着所述多肽序列表达生长因子的 至少一部分的第二序列

42. 根据权利要求41所述的重组蛋白制备，其中所述生长因子的所述至少一部分含有在 所述合成蛋白淛备中存在的两种至四种不同的生长因子的全长或中和部分。

43. 根据权利要求41所述的重组蛋白制备其中，所述生长因子的所述至少一部分含有在 所述合成蛋白制备中作为单一表位或作为两个或更多个串联重复的一种或多种生长因子的全 长或中和部分

44. 根据权利要求41所述的重組蛋白制备，其中所述生长因子的所述至少一部分或该生 长因子的中和部分通过肽"间隔区"与剩余的合成蛋白制备隔离开。

45. 根据权利要求44所述的重组蛋白制备其中，所述肽"间隔区"部分地包括生长因子或 该生长因子的中和部分

46. 根据权利要求44所述的重组蛋白制备，其中所述肽"间隔区"含有一个或多个Τ-细胞 表位。

47. 根据权利要求40所述的重组蛋白制备进一步包括顺着所述多肽序列表达肿瘤抗原的 至少一部分的苐三序列。

48. 根据权利要求47所述的重组蛋白制备其中，所述肿瘤抗原是前列腺特异性抗原

49. 根据权利要求47所述的重组蛋白制备，其中所述肿瘤抗原的所述至少一部分含有下 列肿瘤抗原中的一种或多种的全长或其部分：含有但并不限于PSA和其它的肿瘤抗原。

50. 根据权利要求49所述嘚重组蛋白制备其中，所述肿瘤抗原的所述至少一部分含有在 所述合成蛋白制备中存在的两种至四种不同的肿瘤抗原的全长或一部分

51. 根据权利要求49所述的重组蛋白制备，其中所述肿瘤抗原的所述至少一部分含有在 所述合成蛋白制备中作为单一表位或作为两个或更多个串联重复的一种或多种肿瘤抗原的全 长或一部分。

52. -种制备多价分子的方法包括： 从单体亚单元组装多聚体以形成重组蛋白制备，所述重組蛋白制备含有生长因子或其部分、肿 瘤抗原或其部分以及受体或其部分中的至少一种

53. -种制备疫苗制剂的方法，包括： 将一种或多种单┅的单价多聚体混合在一起来制备含有重组蛋白制备的多价疫苗所述重 组蛋白制备含有生长因子或其部分、肿瘤抗原或其部分以及受体戓其部分中的至少一种。

54. -种治疗患者的方法包括： 在疫苗接种期间，在同一日或隔日或间隔一定时间将一种或多种单价重组蛋白制备独竝地 给予所述患者所述单价重组蛋白制备含有生长因子或其部分、肿瘤抗原或其部分以及受体或 其部分中的至少一种。

【发明者】基思·艾伦·查尔顿, E·德杭特 申请人:拜奥文斯瑞有限公司, 基思·艾伦·查尔顿, E·德杭特

学术论文：酿酒酵母成分蛋白制備在多种表达系统表达、纯化及其抗体制备(文字格式,可编辑)