小干扰RNA抑制HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒複制与表达
目的了解基于载体的siRNA对HepG2.2.15细胞中HBV的抑制作用,观察特异性siRNA载体对细胞的毒副作用及可能的非靶向效应,探讨新的抗病毒治疗手段方法根据GenBank收录HepG2.2.15细胞系中HBV基因全序列,设计构建针对HBV的C基因区的3条siRNA的双链复合体,经退火连接入p-Silencer-Cmv4.1载体,连接产物转化JM109细胞,载体经聚丙烯酰胺凝膠电泳及测序鉴定后中量超纯手机公积金提取流程图质粒,定量后与转染试剂siPort
DNA拷贝数降低102个数量级。而MTT检测表明该特异性siRNA表达载体不影响细胞的生长曲线与生长率,治疗组与对照组比较无差异ELISA法检测表明特异性siRNA并不影响细胞干扰素的表达,p-C1、p-C2、p-C3组与未转染组、p-NC组比较表达均无差異。结论基于载体的特异性siRNA在体外可抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达该抑制作用是特异性的,同时对细胞无明显毒副作用。该作用为基因水平的裂解作用,不会出现耐药现象
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DNA合成的抑制作用方法:采用四甲基噻唑蓝(MTT)法检测MFA对HepG2.2.15细胞的半数毒性浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0);在TC0基础上观察5个不同浓度药物作用于HepG2.2.15细胞,分别在第4d和8d收集细胞培养上清液,采用实时熒光定量PCR法检测上清液HBV
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