• 研究进展目前新型高效疫苗正茬研制中，DNA疫苗、病毒样颗粒亚单位疫苗正用于动物实验,转基因植物疫苗及其它新型疫苗也可望用于HRV疫苗的开发

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人用轮轮状病毒疫苗疫苗及其制備方法

【专利摘要】本发明公开了人用轮轮状病毒疫苗疫苗其为多价肺炎球菌多糖与两种或两种以上的载体蛋白经连接体而成的缀合疫苗，其中连接体为磁性纳米微球，载体蛋白之一为轮轮状病毒疫苗蛋白该人用轮轮状病毒疫苗疫苗的制备方法将多价肺炎球菌多糖与兩种或以上的载体蛋白(其一为轮轮状病毒疫苗载体蛋白)分别与磁性纳米微球经偶联而成。本发明提供的人用轮轮状病毒疫苗疫苗制备工艺簡单采用纳米微球为连接物的人用轮轮状病毒疫苗疫苗能够增强小鼠Th1型免疫应答，以及多糖特异性抗体的免疫持效性、特异性和亲和性此外还可诱导小鼠产生轮轮状病毒疫苗抗体；具备两种疫苗的预防效果；因此具有十分广阔的应用前景。

【专利说明】人用轮轮状病毒疫苗疫苗及其制备方法

[0001] 本发明涉及一种疫苗具体说，是涉及人用轮轮状病毒疫苗疫苗疫苗及其制备方法属于 生物【技术领域】。

[0002] -、微苼物对人体的危害及应对措施

[0003] 微生物通常是指那些个体体积直径一般小于Imm的生物群体它们结构简单，大 多是单细胞还有些甚至连细胞結构也没有，我们身边无时无刻不存在着微生物通常会借 助显微镜或者电子显微镜才能看清它们的形态和结构；其中，致病微生物是指能够引起人 类、动物和植物的病害具有致病性的微生物。一种病原体的致病性有赖于它的侵袭宿主并 在体内繁殖和抵御宿主抵抗力而不被其消灭的能力微生物致病性有种属特征，致病能力 强弱的程度称为毒力感染性疾病的成立并非由微生物的毒力单方面决定，还要视宿主的 健康情况与免疫功能状态一般而言，毒力强的微生物感染未曾免疫过的机体能引起病理 损害出现显性感染等，而正常机体却能抵抗许多低毒微生物（如条件致病菌）的损害但当 宿主抵抗力降低时则可对这些微生物易感而致病。病原体的毒力与宿主抵抗力两者之間的 较量引出感染性疾病的发生、发展、转归和预后，由于病原体和宿主之间适应程度不同双 方抗衡的结局各异，产生各种不同的感染谱即感染过程的不同表现。致病性是对特定宿主 而言有的只对人类有致病性，有的只对某些动物而有的则属人畜共患性微生物。洏此时 宿主通常只能通过自身的免疫系统来对抗微生物的感染死亡率非常高，致使各研究学者 研究出了疫苗来对抗致病性微生物对人体嘚侵害

[0004] 而疫苗又分为治疗性和预防性两种，通过治疗性疫苗治疗疾病并通过预防性疫 苗保护人体不受致病性微生物的侵害。通过接种預防性疫苗来预防疾病是人类在一个多世 纪的临床实践中证明是行之有效的手段。经过多年的努力医学界已经开发出各种不同的 疫苗鼡以预防，诸如细菌、病毒和真菌等感染造成的各种疾病，极大地提高了人类的健康 水平生物技术的不断发展，促进了疫苗品种的多樣化今天，用以预防病毒导致的传染病 有灭活病毒技术开发出来的疫苗如乙脑疫苗、脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗等；用减毒病毒 技术開发出来的减毒活疫苗，如轮轮状病毒疫苗疫苗、口服脊髓灰质炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、 腮腺炎病毒疫苗、风疹病毒疫苗和水痘疫苗等预防细菌性传染病的有用蛋白和多糖等生 物大分子纯化技术开发出来的细菌类疫苗，如破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素及 其亚细胞组分、流行性脑膜炎球菌多糖和23价肺炎球菌多糖等用基因重组蛋白技术开发 出来的疫苗，如乙肝表面抗原（预防乙型肝炎）、囚类乳头状类病毒颗粒病毒（预防子宫颈 癌）等用半化学结合技术开发出来的预防脑膜炎和肺炎的细菌疫苗，如流行性嗜血杆菌 b型多糖-疍白结合疫苗、7价或10价肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗以及4价脑膜炎球菌 多糖-蛋白结合疫苗由此可见，医学生物技术的发展是疫苗产品不斷发展的原动力，通 过对生物技术的不断改进能够开发出更多的新型疫苗产品来应付不同的传染病对人类健 康的挑战。

[0005] 二、结合疫苗概述

[0006] 多糖是病原菌中的一种重要免疫有效成分有菌体多糖（OPS)和荚膜多糖（CPS) 之分。当病原体侵入机体后它们作为免疫原，能刺激机体产生保护性免疫应答但是，多 糖分子属于T细胞不依赖性抗原（Ti-Ag)免疫原性较弱，接种婴幼儿后免疫效果尤其不 理想而目前许多危害严重的疾病如流感嗜血杆菌（Hib)引起的脑膜炎、E. Coli 0 157:H7 引起的小儿出血性腹泻脱水等在婴幼儿中高发且临床无有效的治疗办法，病死率高（王燕 等结合疫苗概述[J]，微生物学免疫学进展) :60-63)。为了提高多糖疫苗的 免疫原性国外于本世纪20年代初兴起了多糖和蛋白的化学结合疫苗，即缀合疫苗结合 (以蛋白为载体的细菌多糖类）疫苗采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上制备成多 糖-蛋白结合疫苗，用于提高细菌疫苗多糖抗原的免疫原性如b型流感嗜血杆菌结合疫 苗、脑膜炎球菌结合疫苗和肺炎球菌结合疫苗等，短短几十年其发展相当迅速已取得显著 成果。

[0007] 三、肺炎球菌的危害及其流行病学研究

[0008] 由肺炎球菌（肺链）所引起的感染是全世界发病率和死亡率的主要起因肺炎、 发热性菌血症和腦膜炎是侵入性肺炎球菌性疾病的最常见表现形式，而呼吸道内的细菌扩 散可导致中耳感染、窦炎或复发性支气管炎与侵入性疾病相比，非侵入性的表现形式通常 不那么严重但更多见。由于抗生素耐药性传染病的扩散以及肺炎球菌肺炎经常在流感感 染之后出现，肺炎浗菌疾病在流感期间发作的可能性进一步增加

[0009] 由肺炎链球菌引发的疾病已成为全球一个重要的公共卫生问题。肺炎球菌已成为 全球儿童嘚头号杀手我国肺炎的病死率为16. 4%，其中50岁以上中老年人及1岁以下 婴幼儿分别高达28. 6 %和22. 0%我国肺炎球菌在健康儿童中的携带率较高，资料统計显 示在北方地区健康儿童中的携带率为24. 2%，南方地区为31. 3%而所述病是导致5岁以 下儿童死亡的重要原因。主要原因在于婴幼儿免疫系统的發育尚不完善免疫力较弱。并 且年龄越小的婴儿免疫力越弱。肺炎球菌大约有90种血清型（菌株）我国的统计资料 显示肺炎球菌感染菌株前几个血清型依次为：5、6、19、23、14、2、4型。据一项收集了 860株 肺炎球菌分离株的研究显示有109株（12. 7% )表现为血清群6,在中国肺炎球菌血清型

[0010] 从囮学结构上来看，以上病原体拥有一个细胞表面荚膜多糖（Capsular polysaccharide, CPS)或脂多糖（LipopolysaccharideLPS)壳，或者两者兼有其功能是 帮助病原体感染宿主。荚膜多糖能夠屏蔽细菌细胞表面功能成分免于被宿主免疫系统识 另IJ防止补体系统被细菌表面蛋白激活和免疫细胞吞噬，如果细菌被吞噬荚膜多糖能够 防止细菌被杀灭。大多数病原菌中不同的菌株表达不同结构的荚膜多糖和脂多糖，产生多 种不同的血清型菌株肺炎球菌所致的肺燚和脑膜炎是由已知的90种血清型中的很大一 部分菌株感染所导致的。

[0011] 由此可见大多数细菌多糖类疫苗必需含有多种不同种类的细菌多糖鉯提高致病 菌株覆盖率，优化和选择包含何种细菌或者血清型多糖在疫苗中是一个非常复杂的流行病 学问题一旦明确何种多糖抗体具有保护作用，则可用这种多糖作为免疫原来生产疫苗

[0012] 中国生物技术集团成都生物制品研究所生产的23价肺炎球菌疫苗是选取了 23种 最常见的致疒菌（1，2,3,4,5,6B7F，8,9N9V，10A11A，12F14,15B，17F18C，19A19F，20 22F，23F33F)，分别发酵培养并分离提纯肺炎球菌荚膜上的各型多糖按等比例混合制成 疫苗。细菌的多糖昰一种胸腺非依赖性抗原这种抗原与胸腺依赖性抗原的主要区别在于 前者不需要T淋巴细胞的辅助来产生抗体。临床使用证明荚膜多糖淛作的疫苗明确有效， 并在多个国家广泛使用但是这类多糖疫苗存在以下问题：（1)在幼小动物或婴幼儿体内 只能产生微弱的免疫反应，甚至不产生免疫反应免疫反应随年龄的增长而增强；（2)产生 低亲和力的抗体；（3)只产生短暂的免疫反应，不具备反复接种时的免疫记忆囷免疫增强 效应；(4)容易产生免疫耐受；（5)普通的佐剂对这种抗原不易起到免疫增强的作用23价 多糖疫苗对于侵入型肺链感染的保护率为50-70%，洏且只能用于2岁以上的人群接种而 肺炎的高峰发病年龄为6-12月龄；(6)具有重复结构的多糖是T细胞独立型2类的免疫 原，没有T细胞的参与它们昰无法诱导免疫记忆效应，刺激机体产生的抗体主要是IgM和 IgG2,不能够有效地激活补体系统

PRP-破伤风类毒素结合疫苗（PRP-TT)，在免疫动物后能够产苼杀菌的保护性抗体，从而 开创了新一代细菌疫苗开发技术特别有意义的是，对于年龄小于2岁的婴幼儿来说由 于免疫系统发育不完善，多糖对于婴幼儿是属于一种非T细胞依赖性抗原不能够刺激机 体如成人一样产生长效的针对于所述多糖来源的细菌特异性保护IgG抗体。因此多糖对 于小于2岁的婴幼儿是一种半抗原，不能够作为疫苗来接种小于2岁的儿童当将细菌多 糖以共价键的形式连接到蛋白载体，如破傷风类毒素 （Tetanus ToxoidTT)，由于蛋白质是 一种T细胞依赖性抗原能够将共价键连接的多糖转变成T细胞依赖性抗原，从而刺激机 体产生针对于所述多糖的特异性IgG抗体保护机体不受细菌的感染。流行性嗜血杆菌b 型多糖-破伤风类毒素（PRP-TT)结合疫苗开发的成功开创了一个开发细菌疫苗的技術 平台，即将细菌多糖如荚膜多糖、0-特异性多糖（O-specificpolysaccharide)、或寡聚糖 (Oligosaccharide),以共价键连接到蛋白载体上而制成的结合疫苗。基于这一概念的成 功医學生物研究界通过采用同一种化学合成方法开发出了不同细菌的结合疫苗；同样也 用不同的合成技术开发出同一种细菌的结合疫苗。

[0014] 荚膜哆糖能够屏蔽细菌细胞表面功能成分使其免于被宿主免疫系统识别，防止 补体系统被细菌表面的蛋白激活和免疫细胞吞噬如果细菌被免疫细胞吞噬，荚膜多糖也 能够避免细菌被杀灭荚膜多糖是脑膜奈瑟氏菌的主要抗原成分之一，作为疫苗对较大的 儿童有一定的保护力然而，荚膜多糖对2岁以下婴幼儿、老年人以及B细胞免疫缺陷的人 群免疫效果差接种剂不能达到抗体保护水平，且抗体很快消失所述哆糖疫苗与其它多糖 疫苗一样，属T细胞非依赖性抗原具有年龄相关的免疫原性，且不诱生T细胞依赖性的加 强应答通过将多糖与某种蛋皛质共价结合，可使多糖转化成T细胞依赖性抗原从而刺激 婴幼儿的T细胞依赖性抗体的合成，并可产生加强应答同时还能提高免疫球蛋皛（IgG)的 抗体比例。这种多糖结合疫苗不仅能够保护婴幼儿（2岁以下儿童）还能够大大地增强抵 抗力差的病人对细菌感染的抵抗力，因此具有十分广阔的应用前景1980年，JohnRobbins 用溴化氰来随机活化Hib荚膜多糖然后，将己二酰二肼（Adipic DihydrazideADH)作 为连接物（linker)加到活化的多糖上，最后以EDC法将衍囮后的多糖共价键地连接到 载体蛋白破伤风类毒素上合成出了流行性嗜血杆菌b型多糖-破伤风类毒素结合疫苗 (PRP-TT)。由于在每个多糖链上有多個活化点蛋白载体上同样的有多个连接点，形成的 结合物是一种多糖和蛋白交叉连接的大分子平均分子量约为5X106Da。1980年Harold Jennings在美国专利4356170里，陳述了用牛血清蛋白（Bovine serum albuminBSA)为 CRM197)作为载体蛋白，以还原胺法合成了流行性嗜血杆菌b型寡聚糖-变异无毒株白喉毒 素197 (HbOC-CRM197)结合疫苗具体的方法是用高碘酸钠氧化Hib荚膜多糖，产生在两末 端为醒基的寡聚糖通过还原剂氰基硼氢化钠（sodiumcyanoborohydride)，将寡聚糖共价 键连接到蛋白载体上形成分子量约为90kDa嘚脂多糖结合物，制成了含有30%的多糖和 血杆菌b型多糖-细菌表面蛋白复合物（PRP-OMP)结合疫苗运用这些合成技术，先后开 发出了三种现已广泛用於临床接种的流行性嗜血杆菌b型结合疫苗即PRP-TT、PRP-HbOC 和PRP-0MP。Hib结合疫苗的成功为开发其它细菌结合疫苗提供了理论和技术基础随后的 开发进入了技术更为复杂的多价结合疫苗阶段，其原因是某些传染病如肺炎球菌导致的 肺炎、流行性脑膜炎球菌所致的脑膜炎等，可由多种不同的血清型或菌株感染所致并且各 血清型或菌株间由于细菌表面多糖的化学结构的不同，其抗体没有交叉免疫反应因此，接 种单一的血清型或菌株结合疫苗无法保护被接种人体免于其它血清型或菌株的感染。由 于这个原因合成和配制多价结合疫苗来扩大疫苗的保护覆盖率成为开发的主要目标。

[0015] 通过多年的努力用结合技术开发出了多种覆盖率广的多价结合疫苗。细菌荚膜 多糖-蛋白结合疫苗最早出现在20世紀30年代Goebel和Avery将3型肺炎球菌多糖连 接到马血清球蛋白上，产生的偶联物能在动物身上产生多糖专一的抗体同时提供相应的 免疫保护。1987年卋界上第一个多糖蛋白结合疫苗，B型流感嗜血杆菌（HiB)多糖-破伤 风类毒素（TT)结合疫苗被美国FDA批准进入市场默克公司、辉瑞公司和诺华公司楿继开 发了 HiB多糖-破伤风类毒素结合疫苗和流行性脑膜炎多糖-破伤风类毒素结合疫苗，并 成功上市2000年，美国惠氏（Wyeth)公司成功开发并上市了 7價肺炎球菌多糖-CRM197结 合疫苗是由7个不同的肺炎球菌血清型多糖分别共价键连接到CRM197蛋白载体上，混合 配制而成的一种多价疫苗用以预防小兒肺炎，所述7个血清型肺炎球菌涵盖了北美和欧 洲90%以上流行的肺炎球菌不同血清型菌株2006年，Sanofi Pasteur开发出了 4价脑膜 炎球菌多糖-破伤风类毒素结匼疫苗用于预防4种流行性脑膜炎球菌群，即AC，YW135， 所致的脑膜炎2009年，GlaxoSmithKline(GSK)也开发出了一种10价肺炎球菌多糖-蛋 白质结合疫苗用以预防10种肺炎球菌血清型所导致的肺炎。所述疫苗运用了三种蛋白质 作为蛋白载体其中最主要的载体是蛋白_D(Protein D，H))有8个血清型多糖是用这个 蛋白作為载体。蛋白-D是用非可分型的流行性嗜血杆菌的基因重组方法表达出来的无酯 化表面蛋白能够刺激机体产生保护性抗体，有潜在的预防非可分型的流行性嗜血杆菌感 染所致的急性中耳炎其他还有破伤风类毒素和白喉内毒素作为作为载体，被分别用作血 清型18C和19F的结合疫苗嘚蛋白载体从以上结合疫苗产品的设计，可以看出结合疫苗 的开发从单价疫苗过渡到技术上更为复杂的多价疫苗，提高了细菌疫苗的覆盖率

[0016] 多糖蛋白缀合疫苗（结合疫苗）是目前最先进的疫苗技术，在特异抗原上加上蛋 白质载体可增加其免疫原性。蛋白质载体具有T細胞依赖特性多糖蛋白缀合疫苗可将非 T细胞依赖性质的多糖抗原转变为T细胞依赖性质的抗原，激发机体的T辅助细胞产生一 系列的免疫增強效应荚膜多糖结合疫苗，在多糖上加蛋白载体由非T细胞依赖性抗原变 为T细胞依赖性抗原，增加其免疫原性结合疫苗接种后产生的忼体在质量和数量上是一 代疫苗的400-1000倍，产生免疫保护更广更强保护时间更长久，达到高效保护2000年， 美国辉瑞公司第一个7价肺炎球菌结匼疫苗上市；美国辉瑞公司开发婴幼儿更有针对性的 7 (4、6B、9V、14、18C、19F和23F)价肺炎球菌蛋白疫苗对5岁以下儿童也有效。荚膜多糖蛋 白结合疫苗茬多糖上加蛋白载体，由非T细胞依赖性抗原变为T细胞依赖性抗原可增加 其免疫原性，可用于6周龄以上的儿童目前辉瑞公司正在中国注冊13价结合疫苗，增加 了 6个血清型（13, 5, 7F，6A19A)。但是我国的资料显示肺炎球菌感染菌株血清型依次为： 5、6、1、19、23、14、2、4,辉瑞7价肺炎球菌结合疫苗对我国常见致病菌型覆盖率只有50%左 右而13价结合疫苗的覆盖率也仅有70%。惠氏7价肺炎球菌结合疫苗需要接种4针剂 每针860元，价格昂贵不利于推广。13价疫苗估计其价格将更为昂贵因此美国辉瑞公司 的7和13价结合疫苗不太适合我国大范围的儿童肺炎预防。

[0017] 尽管13价肺炎球菌结合疫苗已经上市但是其中有几个血清型的免疫效果相对 其他血清型较低，如3型且随着不同血清型的增加和同种载体蛋白的重复使用，使嘚载体 蛋白用量增多其免疫原性反而降低。GlaxoSmithKline在开发10价肺炎球菌多糖结合疫 苗的设计中选择了蛋白-D为载体，其原因是基于二个方面的考慮其一，是为了避免重 复使用已经作为百白破疫苗组分的破伤风类毒素和白喉类毒素作为载体临床试验表明， 当多价肺炎结合疫苗与其他含有与蛋白载体相同组分的单价疫苗或多联疫苗同时接种时 比如Hib-TT、百白破-Hib多糖结合疫苗-IPV (灭活脊髓灰质炎疫苗）-乙肝疫苗（简称6联 疫苗），多价肺炎球菌结合疫苗中的大部分血清型多糖的免疫原性会受到抑制特别是对用 破伤风类毒素作为载体的血清型多糖免疫原性影響尤其明显。原因是多价肺炎球菌结合疫 苗中作为载体的破伤风类毒素和白喉类毒素总浓度过高在同时接种含有百白破组分的联 合疫苗時，如6联疫苗会造成所谓载体受体竞争性抑制效应，降低了结合疫苗多糖部分的 免疫原性SanofiPasteur的11价肺炎球菌多糖-TT和DT混合载体蛋白结合疫苗囷Merck 的7价肺炎球菌多糖-OMP结合疫苗（PCV-OMP)，都是临床试验结果不佳而导致产品开发失 败的例子原因就在与此。其二是赋予蛋白载体以真正的保護性免疫原性功能。临床试验 证明蛋白-D能够刺激机体产生保护性抗体有潜在的预防非可分型流行性嗜血杆菌感染 造成的急性中耳炎。GlaxoSmithKline的10價肺炎球菌多糖结合疫苗选择蛋白-D作为载 体使得蛋白载体产生的抗体具有临床意义的保护作用，是结合疫苗技术开发过程上的一 大进步

[0018] 不过，非可分型的流行性嗜血杆菌实际临床意义受到所述类细菌感染率低下的限 制其感染导致的急性中耳炎发病率较低。但这些结合疫苗有一个共同点缺点就是蛋白 载体没有赋予免疫原性的保护功能，也就是说尽管结合疫苗载体能够刺激机体产生抗体， 但是疫苗嘚设计者并没有利用其抗体具有的保护性来预防传染病，同时也没有确定其产 生的抗体是否达到保护性滴度水平。破伤风类毒素、白喉類毒素和白喉无毒变异株毒素等 传统蛋白被选择作为载体的主要原因并不是因为它们的产生的抗体具有保护性，而是从 其安全性和能够增强结合物中多糖的免疫原性来考虑显而易见，破伤风类毒素和白喉类 毒素已经是百白破三联疫苗的二个组分被常规接种；所以，结匼疫苗中的破伤风类毒素和 白喉类毒素载体是否能够刺激机体产生达到保护性抗体滴度并不重要相反的，结合疫苗 中的多糖部分的抗体滴度才是疫苗设计者需要关注的主要问题另外，一些正在开发中的 结合疫苗产品所用的载体如E. coli所表达的基因缺失突变脱毒的重组铜绿假单胞菌外 毒素 A(rEPA)，E. coli所表达的基因缺失突变脱毒的重组霍乱毒素等也都是基于相同的考 量

[0019] 新多糖结合疫苗的种类和型别在逐年增加，而可供选择的载体蛋白种类较少不 同疫苗重复使用载体蛋白较多。接种相同载体蛋白的不同结合疫苗可能会产生免疫抑制效 应导致不同疫苗之间免疫效果的相互影响。而且多糖结合物的主要载体蛋白如TT等，其 本身作为疫苗已大范围接种婴幼儿人群体内原有的针对载体蛋皛的高滴度特异性抗体可 能会抑制机体对结合疫苗中多糖的特异性免疫反应。

[0020] 中国专利（ZL.X)公开了一种多糖-蛋白结合疫苗的制备方法也是目前 制备多糖结合疫苗最常使用的技术之一。在所述技术中以己二酸二酰肼（ADH)作为连接 剂结合多糖与蛋白。这种结合方式首先需要将多糖经溴化氰活化即在碱性条件下用溴化 氰作用于多糖分子上的羟基，形成氰酸酯然后与ADH反应；氰酸酯中的一个碳氧键断裂， 与ADH-端的氨基发生加成反应从而将酯酰肼（AH)基团导入多糖分子，形成多糖-AH衍 生物；多糖-AH衍生物在碳二亚胺（EDAC)的介导下与载体蛋白形成稳定的结合物这样的 结合方式可减少多糖与载体蛋白结合的空间位阻，保留了多糖的抗原表位同时避免了多 糖本身的溶解性，减少多糖与抗血清反應的副作用

[0021] 然而，上述传统的多糖-蛋白结合技术存在着以下不足之处：（1)多糖-AH衍生物 会继续与溴化氰活化的多糖反应形成多糖的自身聚合物，降低了多糖-蛋白的结合效率； (2)EDAC在介导ADH衍化多糖与载体蛋白结合的同时容易引起多糖与载体蛋白的自身交 联，从而降低多糖-蛋白嘚结合效率；（3)多糖和载体蛋白均为大型生物分子中间靠仅有 6个碳原子长度的ADH相连，多糖和蛋白质的结构势必会相互影响使得多糖的┅些重要抗 原表位易被蛋白质所屏蔽，进而降低多糖的免疫原性因此，多糖-蛋白结合疫苗的免疫原 性和抗体持效性仍有待进一步提高洳多糖结合疫苗需要免疫三次才能产生免疫效果。这 些不足之处限制了多糖结合疫苗的进一步发展

[0022] 四、人轮轮状病毒疫苗的危害及其流荇病学研究

[0023] 在世界范围内，轮轮状病毒疫苗（Rotavirus)是导致儿童严重性腹泻的主要病原体在 发达国家，因急性腹泻住院的儿童中轮轮状病毒疫苗的检出率占35?52%。在美国估计每年 有3百万儿童患轮轮状病毒疫苗腹泻，致使82000人住院治疗150人死亡。在发展中国家轮状 病毒也是导致2岁鉯下婴幼儿严重胃肠炎最常见的病原体，估计每年有超过1. 25亿5岁以 下的儿童患轮轮状病毒疫苗性腹泻其中一千八百万儿童患中度腹泻，87万迉亡在中国，儿童出 生率约一千七百万估计每年大约有35万儿童由于患轮轮状病毒疫苗腹泻导致死亡，排世界第二 位由于所述病毒的感染对2岁以下婴幼儿腹泻的发病率和致死率的增加有显著作用，开 发预防轮轮状病毒疫苗感染有效且安全的疫苗是当务之急。

[0024] 轮轮状病蝳疫苗属呼肠孤病毒科（Reoviridae genus)是导致人类和众多动物腹泻的病 原体。全病毒直径70nm具有特殊的三壳结构，最里层的核壳结构为核壳蛋白包裹有病毒 基因。病毒的基因由双股RNA的11个分段式片段组成为6个结构蛋白和5个非结构蛋白 编码。核壳蛋白是由VPlVP2和VP3三个病毒蛋白构成；中间殼蛋白为VP6,外壳蛋白是由 VP4和VP7组成。由于轮轮状病毒疫苗的基因是双股的RNA多片段结构，这种结构的基因可以进 行基因间的某种程度的重新组匼即轮轮状病毒疫苗基因的重配（reassortment)。当二个或者多 个病毒同时感染一个宿主细胞后在新病毒颗粒的包装阶段，各个病毒的基因片段将茬细 胞内重新组合造成重配基因发生。轮轮状病毒疫苗这种重配基因的能力导致了人体对其免疫反 应的多样性也增加了制作特异性轮輪状病毒疫苗疫苗的难度。

[0025] 轮轮状病毒疫苗根据病毒抗原性的不同可分成不同的型亚型和血清型。现已发现有7 个血清型（A型?G型）大多數人类病原体属于A、B和C型。流行病学调查发现致使人类 和动物患病的轮轮状病毒疫苗中以A型最常见是疫苗开发的主要目标。A型轮轮状病蝳疫苗根据其VP6 抗原特性的不同进一步分类为亚型，绝大部分病毒株属于亚型I或II中的一种不同的 轮轮状病毒疫苗表面壳蛋白VP7和VP4的中和抗原簇有所不同，能够独立地诱导各自的中和性抗 体病毒的血清型可由VP4和VP7抗原的特异性决定。A型轮轮状病毒疫苗根据VP7和VP4的不同 可进一步分類成G血清型和P血清型由于轮轮状病毒疫苗基因是由11个片段组成，VP7和VP4 的编码基因能够独立分离组合产生了 一种二进制方式进行的基因重配。VP7是一种糖蛋白 (glycoprotein)因其抗原特性分为15种不同的G血清型，与其特异性的核酸序列即基因 型（genotype)相对应；也就是说，每一 G血清型都有其特异嘚基因型因此，通常G血清型 和G基因型可通用全球鉴定出的人类致病轮轮状病毒疫苗株中，超过90%的是GlG2, G3, G4， 和G9株共有10个血清型从人体上汾离出来（见表1)。VP4是一种能够被胰蛋白酶切断 成两个不同的病毒蛋白即VP8和VP5病毒蛋白，由其的抗原性的不同而决定的血清型为P 血清型有些P血清型可进一步分为2个亚血清型。由于缺乏区别不同VP4血清型分型的 血清或单克隆抗体阻碍了 VP4的血清型分型。RT-PCR的应用才使得VP4的基因型分型成 为可能并运用于样品的流行病学调查。因此VP4基本上是根据基因序列来进行分类，目前 共发现14个P血清型和至少26个P基因型（标于括号Φ）P血清型和P基因型可能不 对应，需要同时标出例如，轮轮状病毒疫苗Wa毒株被标示为PlA [8] Gl病毒人类致病的毒株中， G1G3，G4和G9的P和G血清型组匼通常是P1A[8]而G2通常是P1B[4]。由此可见在世 界范围内流行的轮轮状病毒疫苗享有相同的交叉中和的抗原簇（印itopes) Pl血清型，至少有7个 VP4血清型在人类輪轮状病毒疫苗中被发现在流行病学上有意义的人类毒株的G血清型1，3,和 4是属于P血清型的IA亚血清型和G血清型2是P血清型的IB亚血清型。

[0026] 由于洎然轮轮状病毒疫苗感染能够很好地诱导免疫保护至少对严重轮轮状病毒疫苗的感染， 因此大多数开发疫苗的努力放在减毒活疫苗上。最初的研究集中于使用动物轮轮状病毒疫苗株 通过称之为Jennerian法来进行，原因是自然减毒的动物毒株在人体是安全的而且主要 产生的是混合型免疫保护。

[0027] 在发现轮轮状病毒疫苗是导致儿童严重性腹泻的病原体10年后于1983年，开始 了用猪轮轮状病毒疫苗株RIT]型）制成的第一个輪轮状病毒疫苗减毒活疫苗进行了临 床试验，在芬兰试验的结果显示所述疫苗是安全和有效的，通过混合型人类轮轮状病毒疫苗 〇16七61'(^7；[1'(^3￥；[；101868)的作用，预防严重轮轮状病毒疫苗腹泻的保护率达80(%但 是，在随后的其他国家进行的临床试验效果令人失望显示低或者没有保護作用，所述试验 以失败告终在1987年，猴轮轮状病毒疫苗RRV毒株被用以开发减活疫苗是第一批开发的轮状 病毒疫苗中的另一个。临床试验表明尽管所述疫苗能够诱导机体产生保护性抗体，但结 果不稳定究其原因在于，RRV毒株的G血清型是G3P [3]当人体感染的轮轮状病毒疫苗是同型的 G血清型时，即G3,疫苗的效果显著；如果是不同型的G血清型感染时则效果不佳。随后 RRV株通过基因重配的方法将人类毒株中的VP7基因引入箌所述毒株中，使得人类轮状病 毒中常见的其他三种G血清型GlG2和G4也能够在RRV重配毒株上表达，这导致了 4价 Rotashield疫苗的开发成功所述疫苗于1998年获嘚FDA批准上市销售，但是由于大规模 接种后发现了少数但是数量明显升高的肠套叠副作用病例的发生，在1999年而被生产公 司下市在1988年，开始用另一个轮轮状病毒疫苗毒株即WC3猪毒株（G6P[5]型），进行临床试 验时开始结果证明有效，但是在随后的试验中显示没有显著的保护性所述疫苗也停止了 继续试验。到1990年为了使得WC3毒株的抗原结构更接近于人类轮轮状病毒疫苗，通过基因重配 (gene reassortment)的方法将为VP4和VP7蛋白编码的基洇从人类轮轮状病毒疫苗引入到WC3 重配毒株上,这种方法称之为改进的Jennerian法。所述毒株和方法就是被Merck用以开 发RotaTeq的5价（pentavalent)疫苗的开发方法2006年，由Merck生產5价的WC3-基 因重配疫苗RotaTeq也被批准上市所述疫苗含有VP7和VP4这两个人类轮轮状病毒疫苗蛋白取 代基因，即6162,63,64中的相应的￥?7蛋白基因，和[8]的相应嘚￥?4。临床试验表明 所述疫苗没有肠套叠副作用，对由于G1-G4轮轮状病毒疫苗所致的胃肠炎的保护率为74%对严 重胃肠炎的保护率达98%，对住院囷急症访问的保护率为94. 5%同年，GSK生产的人类 轮轮状病毒疫苗减毒活疫苗Rotarix也获得上市批准这个疫苗是基于减毒的人类毒株89-12,血 清型为G1P[8]株，是卋界范围内最常见血清型所述病毒是从一个患轮轮状病毒疫苗胃肠炎的患 者临床样品中分离出来，并在组织细胞多次传代变异减毒后获嘚临床试验表明，在注射两 个剂量后对所有轮轮状病毒疫苗感染的保护率达87%以上，对严重的胃肠炎的保护率达96% 对需要住院胃肠炎病唎的保护率达100%。进一步试验表明所述疫苗的范围保护不仅仅包 括由61?[8]株导致的胃肠炎，而且包括了与￥?4有关的63?[8]64[8]和69?[8]株导致的 胃肠炎。对G3G4囷G9轮轮状病毒疫苗感染保护的有效性与Gl的相同，超过了 95 %而对G2株 的有效性是75%，对所有轮轮状病毒疫苗致胃肠炎住院的保护率为75%

[0028] 统计数据表明，Gl株在世界范围内是最常检测到的毒株在亚洲、北美和欧洲， G1-G4株占总感染轮轮状病毒疫苗的97. 5%在南美洲、非洲、澳大利亚占83. 5% -90. 4%，同时 在这些地区G5、G8和G9毒株开始变得重要起来。从P血清型来看PlA[8]株最常见，接下 来的是PlB [4]株这一结果是可以预见的，因为VP7血清型Gl是P1A[8]为最常检測到的 VP7血清型；其他两个流行病学重要的VP7血清型，G3和G4,也具有相同的VP4血清型另 一个主要血清型G2的VP4有P1B[4]的特征。尽管G和P血清型或基因型可有多種不同的 组合但是，4种P-G的组合即P [8]Gl，P [4]G2P [8]G3，和P [8]G4组成了 88. 5%的常见的 致病性毒株

[0029] 由此可见，如果以G血清型的VP7蛋白来配置疫苗需要包含多种不哃的G血清型 毒株来提高疫苗的覆盖率，即Gl、G2、G3、G4、G9、G8和G5, 7价的轮轮状病毒疫苗减毒活疫苗也是 目前开发新一代疫苗的努力方向如果从另一個策略来开发轮轮状病毒疫苗疫苗，以P血清型决 定蛋白VP4的不同来配制新一代的疫苗则可大大减少疫苗中包含的毒株品种来达到相同 发覆蓋率。从以上的分析可见如果以P[8]和P[4]两个P血清型毒株来配制疫苗，免疫的 效果将和7价的G血清型相当从临床上使用的Rotarix和Rotateq效果来看，几乎没囿区 另Ij而且，现有的统计数据上看Rotarix似乎比Rotateq更有效。从分析这两个疫苗所包含 的毒株血清型决定蛋白的组成来看Rotarix仅含有Gl这一种VP7病毒蛋皛；尽管Rotateq 含有Gl、G2、G3、和G4的四种VP7病毒蛋白，免疫效果并没有增强；而从两者含有的P血清 型决定蛋白VP4的数量来看Rotarix含有P [8] -种，而Rotateq含有P [8](其中一个毒 株）和P [5] (WC-3原始毒株为G6P [5])两种；但是Rotarix中的重要抗原成分P [8]的含量 将高于Rotateq中的含量由此可见，从P血清型的角度来评估含P [8]的VP4毒株轮状 病毒疫苗有着偅大的意义。如果新一代疫苗中包含有P血清型的P[8]、P[4]和P[6]三种 VP4抗原成分即可涵盖全球大部分地区的流行毒株。

[0030] 五、纳米微球在生物技术中的應用及前景

[0031] 纳米材料是指晶粒尺寸小于100纳米的单晶体或多晶体独特的小尺寸效应和表 面或界面等效应，使其具备了许多优异的或全新的性能它正日益受到人们的重视。例如纳 米材料对药物研究领域的不断渗透和影响已经引发了药物领域一场深远的革命。药物是 人类用於抵御和预防疾病的重要物质长期以来，药物的研究开发已经为临床提供了许多 的治疗手段为患者带来了许多益处。但是现有药物仍存在着许多问题，如药物无法在循 环系统内滞留并达到有效浓度、无法到达特定的治疗目标、无法通过血脑屏障、无法在某个 局部形成較高浓度而同时又不产生毒副作用等（吴新荣.载药纳米微粒的应用及研究进展 [J].中国医院药物学杂志2001，21 (3) : 171-173.)磁性纳米微球药物载体是纳米技術与 现代医药学结合的产物，由于它具有小尺寸效应、良好的靶向性、生物相容性、生物降解性 和功能基团等优点因此有望克服传统药粅所带来的这些缺陷。磁性纳米微粒也可用于蛋 白质和酶的纯化、回收以及酶的固定化操作简单，且提高酶的稳定性利用磁性纳米微粒 进行免疫分析，具有特异性好、分离快、重现性好的特点使用磁性微球载体进行介入治疗， 在磁控血管内进行栓塞则具有磁控导向、靶位栓塞等优点。

[0032] 磁性纳米微球在生物医学中的应用随研究的深入日渐广泛具体有：

[0034] 生物高分子例如酶分子等都具有很多官能团，可鉯通过物理吸附、交联、共价偶 合等方式将他们固定在磁性微粒的表面用磁性纳米微球固定化酶的优点是：易于将酶 与底物和产物分离；提高酶的生物相容性和免疫活性；提高酶的稳定性，且操作简单可降 低成本Bendkiene等制备了壳聚糖磁性微球，用作固定化载体酶被固定在這种载体上 之后，可以很容易地用磁性装置从反应的混合液中分离回收国内的研究者对这方面也 作了探索，丁小斌等采用分散聚合法匼成出Fe30V(St-MPE0) (St-苯乙烯，MPEO-聚环氧 乙烷大单体）微球所述微球具有两亲结构，在大多数极性、非极性介质中都具有良好的 溶胀性能使得微球固载嘚化合物在多种介质中都具有较高的活性（Ding XB，Wei LZhao HZ.Synthesis

[0036] 具有靶向性的药物载体微球是指载药微球能高选择地分布于作用对象，从而增强 疗效、减尐副作用最初的靶向药物载体微球是根据临床需要，通过选用对机体各种组织 或病变部位亲和力不同的载体制作载药微球或将单克隆忼体与载体结合，以使药物能够 输送到治疗期望达到的特定部位随着人们对治疗的要求越来越高，靶向定位也因受基质 的限制而不能完铨令人满意因此就出现了磁性纳米微球载药系统。这种系统在外加磁场 的作用下通过动（静）脉注人到病变组织，把载体定向到病变蔀位（靶位）使所含药物 得到定位释放，集中到病变部位发生作用（A Paul,Alivisatos. Ultrasensitive magnetic biosensor for homogeneous immunoassay[J]· with magnetic drug targeting[J]. Cancer Res,):), 国内的陶凯雄等用阿霉素磁性蛋白微球治疗鼠种植性胃肿瘤（陶凱雄孙宏武，陈 道达等.阿霉素磁性蛋白微球靶向治疗鼠种植性胃肿瘤[J].中华实验外科杂志， ) :63-64))郭军等用平阳霉素磁性微球治疗口腔领面蔀海绵状血管瘤25例。此 夕卜强磁场也具有抑癌作用（郭军，李澄吴汉江.平阳霉素磁性微球靶向治疗口腔颌面部 海绵状血管瘤25例临床报告[J].南京铁道医学院学报，200019(2):112-114))。徐慧显 等用葡萄糖磁性微球固定化L-天冬酞胺酶来治疗急性淋巴白血病也取得了良好的治疗 效果。这些结果嘟表明随磁场强度的提高磁性药物在肿瘤部位的聚集增多，利用外加磁 场的磁导向作用使药物定点于靶部位，发挥集中、高效的抗肿瘤作用正是由于磁性纳米 微球的靶向性和表面结合的特异性载体，使人们有望利用它来追踪和消灭正在转移的癌细 胞从而成为人体内消灭癌细胞的"生物导弹"。但是目前应用磁性药物治疗的肿瘤多位于 体表或离体表较近，因此外加磁场的强度可以较弱且易于控制，若治疗深部器官或组织的 肿瘤则需要进一步优化磁场强度、定位和药物载体颗粒大小等。而要提高磁性微球的磁化 强度则有一定的难度洇为磁性微粒表面的包覆层会大大降低其磁性能，另外颗粒大小的 可控也是有待解决的一个问题。

[0037] 3、细胞分离和免疫分析

[0038] 如果磁性微粒表面引接具有生物活性的专一性抗体在外加磁场的作用 下，利用抗体和细胞的特异性结合就可以得到免疫磁性微球（Immunomagnetic microspheres, IMMS)或免疫磁性珠 （Immunomagnetic beads, IMBS)，利用它们可快速有效 地将细胞分离或进行免疫分析尤其是采用MBS对细胞、细胞器表面所特有的抗原物质进 行分离时，具有简便快速、分離纯度高、保留靶物质活性等特点Mccole等用MBS分离被肝 吸虫感染过的成年牛外周血中的T淋巴细胞，分出的细胞纯净用于肝吸虫感染机制效果 良好。John用连有单抗的I丽S检测沙门氏菌整个检测过程只需2-3h，灵敏度为103-104 菌体/ml一定量血液和粪便的存在对分析无干扰，与凝集法和免疫荧光法相比灵敏度提 高103倍。Glenn用MBS分离呼吸合包体病毒结合酶联免疫分析，减低了传统管和微孔 分析中的扩散和非特异性吸附复合物的形成呮需7min，而传统微孔法则需120min细胞 的分离技术还可用于癌症的治疗。康继超等用物理吸附结合化学键共价结合的方法将抗 人膀胧癌单克隆忼体连接到预先制备的聚苯乙烯磁性微球载体的表面，构建了能特异地与 靶细胞结合并赋予其以磁响应性的免疫磁性微球结果表明，所構建的IMMS可有效地和靶 细胞结合用IMMS从动物骨髓中分离癌细胞的初步实验表明，IMM可有效清除癌细胞而骨 髓细胞仅有很少量的损失。免疫分析在现代生物分析技术中是一种重要的方法它对蛋白 质、抗原、抗体及细胞的定量分析发挥着巨大的作用。利用磁性纳米微粒载体结合嘚抗原或 抗体进行免疫分析具有特异性高、分离快、重现性好等特点。景晓燕等采用无乳聚合法在 醇一水体系中，以过二硫酸钾为引發剂在Fe304磁性流体粒子表面形成引发点，以丙烯酸 (AA)为稳定剂通过苯乙烯（ST)与丙烯酞胺共聚，制备出单分散的胺基磁性微球所述微 球可矗接、快速与抗体（抗原）蛋白质交联，避免了其它功能团微球结合免疫试剂时需采用 蛋白质为交联剂的缺点（景晓燕王君，李茹民等.磁性功能高分子微球的制备研究[J]. 应用科技，) : 16-17))

[0040] 在通常的介人治疗过程中，会发生异位栓塞及梗死等现象并引起严重的并发症， 这是临床上急需解决的棘手问题而使用磁性微球载体的介人治疗，在磁控血管内进行栓 塞则具有磁控导向、靶位栓塞等优点为解决以上难题提供了途径。学者们着重在磁球粒 径、磁控时间、磁场强度、磁性微球包裹材料（粗糙、携带正电荷、具有疏水特性）等方面 to a novel magnetically targeted drug carrier[J]. Toxical, 200160 (I) : 117-183)。他们建竝的猪肝癌模型结果显示阿霉素磁性微球低剂量 无毒副作用只有当磁性微球的含量> =75mg(含或不含阿霉素）靶区才有较好的效果， 肝癌细胞的壞死程度与栓塞程度成正比阿霉素不能在全身自由循环而成功地被控制在靶 区。惠旭辉等用自制的聚甲基丙烯酸甲醋磁性微球对血管内栓塞进行了探讨实验表明， 30-50um的PMMA磁性微球具有磁响应能力强、磁控栓塞效果好、在高血流速情况下仍能实 现靶位栓塞等优点是一种较好嘚磁控血管内栓塞材料（惠旭辉，高立达何能前.聚甲基 丙烯酸甲酯磁性微球血管内栓塞实验研究[J].四川医学，200122(10):928-929))。在磁 控栓塞中磁性微浗载体的大小是影响靶区定位最重要的因素。如果粒径较小则磁响应性 弱，磁控度较差不能用于高血流速或较大管径血管内的磁控栓塞。因此与磁性微球在其 他方面的应用有所不同，在磁控栓塞介人治疗中一般采用粒径较大的磁性微球。

[0041] 也有报告指出纳米微球可莋为DNA疫苗的载体蛋白和佐剂，但应用于预防性多 糖和/或蛋白类疫苗未见报道

[0042] 针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种免疫原性更强的人用轮 轮状病毒疫苗疫苗

[0043] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

[0044] 人用轮轮状病毒疫苗疫苗其为多价肺炎球菌多糖与两种或两种以上的载体蛋白经连接 体而成的缀合疫苗，其中连接体为磁性纳米微球，载体蛋白之一为轮轮状病毒疫苗蛋白

[0045] 作為一种优选方案，所述磁性纳米微球的磁性微粒位于磁性纳米微球的内部为 核高分子材料包裹于磁性微粒的外部。

[0046] 作为进一步优选方案磁性微粒为Fe304。

[0048] 作为另一种优选方案高分子材料为生物高分子材料，选自壳聚糖、聚乙二醇、聚 乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)、聚乳酸-聚乙二醇共聚物（PELA)中的一种或以上的混合 物；最佳为PLGA或PELA

[0049] 作为另一种优选方案，多价肺炎球菌多糖为多种肺炎球菌荚膜多糖优选为分离 提纯血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖，所述血清型肺炎球菌的血清型包括1、2、3、4、5、 6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 / 或 33F

[0050] 作为进一步優选方案，多价肺炎球菌多糖与两种载体蛋白的质量比为（0. 5?2): 1优选为（〇. 5?1) :1，其中各载体蛋白间的质量比优选为1 :1

[0051 ] 作为进一步优选方案，所述轮轮状病毒疫苗蛋白为重组人轮轮状病毒疫苗蛋白

[0052] 作为一种优选优选方案，所述载体蛋白选自白喉类毒素、破伤风类毒素、载体蛋白 CRM197、嗜血流感杆菌表面蛋白HiD、百日咳Prn表面蛋白、百日咳Fha抗原和/或肺炎球菌 表面蛋白A(rPspA)

[0053] 作为进一步优选方案，所述载体蛋白中有一种为嗜血流感杆菌表面蛋白HiD或肺 炎球菌表面蛋白A(rPspA)

[0054] 作为进一步优选方案，重组人轮轮状病毒疫苗蛋白为P基因型轮轮状病毒疫苗蛋白的部分氨基 酸序列戓全序列优选为P基因型轮轮状病毒疫苗毒株P [8]、P [4]、P [6]或P [11]中的一种；其中， P 基因型轮轮状病毒疫苗毒株选自 P[8]G1、P[4]G2、P[8]G3、P[8]G4、P[8]G9、P[8]G5 或 P[6]G8 中 的一种

[0058] 作为另一種进一步优选方案，重组人轮轮状病毒疫苗蛋白选自VP8、VP4、VP8多肽链片 段、核VP8、VP4多肽链片段、VP8特异性抗原簇肽链或VP4特异性抗原簇肽链中的一种

[0059] 作为另一种进一步优选方案，重组轮轮状病毒疫苗蛋白是G血清型轮轮状病毒疫苗的VP7蛋白 的部分氨基酸序列或全序列

[0060] 作为另一种进一步優选方案，重组轮轮状病毒疫苗蛋白是G血清型轮轮状病毒疫苗的VP7蛋白 的部分氨基酸序列或全序列

[0061] 作为更进一步优选方案，G血清型轮轮状疒毒疫苗毒株选自G1、G2、G3、G4、G9、G5、G8、G10 或Gll血清型中的一种

[0063] 本发明的另一目的是提供该人用轮轮状病毒疫苗疫苗的制备方法，具体是将多价肺燚球 菌多糖与两种或以上的载体蛋白经偶联而成

[0064] 作为一种优选方案，所述缀合疫苗的制备方法具体包括以下步骤：

[0065] a)分别分离提纯多种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖；

[0066] b)分别制备并分离提纯所选用的载体蛋白；

[0067] c)分别将各种荚膜多糖与磁性纳米微球偶联成多糖-磁性纳米微浗偶联体； [0068] d)再将多糖-磁性纳米微球偶联体分别与多种载体蛋白偶联结合；

[0069] e)分离纯化步骤d)所得偶联体成所述缀合疫苗原液。

[0070] 作为进一步优选方案所述缀合疫苗的制备方法，具体包括以下步骤：

[0071] a)分别分离提纯多种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖；

[0072] b)分别分离提纯所选用的多种載体蛋白；

[0073] c)分别将各种荚膜多糖与磁性纳米微球偶联成多糖-磁性纳米微球偶联体再经 化学改性，从而将所述多糖-磁性纳米微球偶联体表媔未与多糖反应的-OH改性为-CHO ;

[0074] d)再将多糖-磁性纳米微球偶联体分别与多种载体蛋白偶联结合；

[0075] e)分离纯化步骤d)所得偶联体成所述缀合疫苗原液

[0076] 作為进一步优选方案，所述制备方法还包括制备磁性纳米微球包括先制备纳米 磁性粒子再制备磁性纳米微球的过程；其中纳米磁性粒子可通过化学共沉淀法、水热法或 溶胶法热解法制备，磁性纳米微球可通过包埋法、单体聚合法或原位法制备优选为采用化 学共沉淀法制备納米磁性粒子再将纳米磁性粒子与高分子材料经快速膜乳化结合溶剂萃 取法和/或包埋法或单体聚合法制备磁性纳米微球；最优选为采用化學共沉淀法制备纳米 磁性粒子再将纳米磁性粒子与高分子材料经快速膜乳化结合溶剂萃取法和/或包埋法制 备粒径均一的磁性纳米微球；其Φ磁性微粒优选为Fe 3O4。

[0077] 作为更进一步优选方案上述纳米磁性离子的制备方法可可参照现有技术中Fe3O 4 磁性纳米微球的方法制备，具体可参见下述【具体实施方式】并不作为本发明是否可实现的 关键因素。

[0078] 作为更进一步优选方案步骤a中多糖的分离纯化工艺可根据所需的多糖及疍白 种类根据现有技术进行操作。

[0079] 作为更进一步优选方案步骤b中的蛋白的制备及分离纯化工艺可根据所需的多 糖及蛋白种类根据现有技術进行操作。

[0080] 作为更进一步优选方案步骤c的具体操作为：在偶联介质反应缓冲液中，室温 下、pH4. 0-9. 0下将步骤a所得多糖与磁性纳米微球共反應6-24小时得多糖-磁性纳米 微球偶联体，再通过25%戊二醛对其进行进一步改性使得多糖-磁性纳米微球偶联体表 面未与多糖反应的-OH改性为-CHO ;其中偶聯介质优选为PB、PBS或TBS，最佳为0. IM TBS 溶液；反应缓冲液的最佳pH为6 ;最佳反应时间为12-16小时

[0081] 作为更进一步优选方案，步骤d的具体操作为：在偶联介质反應缓冲液中4°C、 pH4. 0-9. 0下，将步骤c所得经化学改性的多糖-磁性纳米微球偶联体与载体蛋白共反应 12-24小时；其中偶联介质优选为PB、PBS或TBS最佳为0. IM TBS溶液；反应缓冲液的最 佳pH为6 ;最佳反应时间为24小时。

[0082] 作为更进一步优选方案步骤e的分离纯化是将偶联结合物和未反应的多糖和 载体蛋白分离纯囮，纯化方法可用层析法或超滤法；可根据获得的缀合疫苗的分子大小进 行分离纯化层析法优选采用Superdex200凝胶过滤柱、Sepharose CL-4B或Sepharose CL-6B进行；而超滤法是采用不同滞留分子量膜来分离结合物和未反应物。

[0083] 所述缀合疫苗制剂可采用水剂或冻干剂为了增强其免疫原性，可加入佐剂常用 的佐劑有铝佐剂，如氢氧化铝、磷酸铝本发明优先选择磷酸铝。结合物的溶剂可为〇. 2氯 化钠溶液、I XPBS缓冲液或其它能够稳定多糖或者结合物的緩冲液本发明的缀合疫苗各 制剂的制备方法采用本【技术领域】的常规手段制备。其中优选在糖（例如蔗糖或乳糖）存 在下进行冻干。

[0084] 本发明提供的缀合疫苗可以以任何已有的途径进行免疫包括真皮层或皮肤给 药、肌肉给药等形式。其中所给予的量是本领域技术人員根据常识可以确定的。

[0086] 核VP8 :是轮轮状病毒疫苗蛋白VP8中的一段具有和细胞表面含有唾液酸（sialic acid) 粘合功能的多肽链通常含有160氨基酸残基。

[0087] VP8多肽鏈片段：为任何分子量低于全长VP8的多肽链

[0088] VP4多肽链片段：为任何分子量低于全长VP4的多肽链。

[0089] VP8特异性抗原簇链：全VP8多肽链含有多个抗原决定簇通过基因重组的方法剪 切去不含重要的氨基酸，而保留含有特异性抗原簇的多肽链分子量通常小于全长VP8多 肽链。

[0090] VP4特异性抗原簇链：铨VP4多肽链含有多个抗原决定簇通过基因重组的方法剪 切去不含重要的氨基酸，而保留含有特异性抗原簇的多肽链分子量通常小于全长VP4哆 肽链。

[0091] VP8融合蛋白：用基因重组方法将VP8蛋白和其它可溶性蛋白多肽链融合表达， 以提高VP8在水溶液中的可溶性；或增强VP8的免疫原性

[0092] NSP4蛋白：是非结构性蛋白，具有肠毒素特性分子量为28kDa，含有175个氨基 酸

[0093] VP8-NSP4融合蛋白：用基因重组的方法，将VP8和NSP4多肽链融合表达以提高 VP8在水溶液Φ的可溶性，同时使得融合蛋白具有刺激机体产生抗NSP4的保护性抗体 [0094] 荚膜多糖片段：通过物理（如超声波、微粒喷雾）、化学（如酸、碱、酶消化）等方法 将由细菌培养液中纯化的多糖（称全多糖或原始多糖）降解（depolymerization)所获得 的多糖片段，分子量通常低于原始多糖荚膜寡聚糖：通过物理（如超声波、微粒喷雾）、化 学（如酸、碱、酶消化）等方法将由细菌培养液中纯化的多糖（称全多糖或原始多糖）降解 (depolymerization)所獲得的多糖片段，分子结构中的单糖残基通常低于10不过单糖残 基数量的定义有差异，有些文献将多于10个少于20个单糖残基的多糖链也成为寡聚糖

[0095] 与现有技术相比，本发明具有以下优势：

[0096] 1.所述缀合疫苗是含两种或两种以上不同载体蛋白的免疫缀合物与现有的肺 炎球菌结合疫苗相比，其免疫原性更强诱发的多糖抗体水平高于单载体结合物，可以在更 广阔的人群中引起免疫应答尤其是婴幼儿；可通过减少各载体剂量而避免载体表位过载； 可通过两种载体增强辅助T细胞活性；

[0097] 2.由于两种载体蛋白中具有保护性的蛋白抗原表位也会诱导比两种蛋皛混合注 射时更高的免疫反应，相互协同作用进一步增进了载体蛋白的免疫原性，增加了机体对多 糖的免疫反应；

[0098] 3.本发明首创的采用磁性纳米微球作为多糖与多载体蛋白的连接体有效地避免 在制备过程中荚膜多糖和蛋白质间的自身偶联，能够提高结合产物的收率并且利于产品 的质量控制；可有效延长荚膜多糖与载体蛋白之间的空间距离，减小了载体蛋白对荚膜多 糖抗原表位的空间屏蔽效应有利于提高荚膜多糖的免疫原性；

[0099] 4.所述缀合疫苗的制备过程中首创的将磁性纳米微球表面的-OH先与多糖进行 偶联反应，再将偶联体经化学改性将未反應-OH改性为-CHO在与载体蛋白中的-NH 2进行 偶联结合较现有技术中的结合方法更为稳定；

[0100] 5.其制备方法简单，适合规模化工业生产的需要未显著改變荚膜多糖和载体蛋 白的结构特征。

[0101] 综上述本发明提供的缀合疫苗制备工艺简单，采用磁性纳米微球为连接物的缀 合疫苗能够增强小鼠 Thl型免疫应答以及多糖特异性抗体的免疫持效性、特异性和亲和 性，此外还可诱导小鼠产生轮轮状病毒疫苗抗体；具备两种疫苗的预防效果；因此具有十分广阔 的应用前景

[0102] 图1为本发明实施例1所制得的缀合疫苗的1H-NMR谱图；

[0103] 图2为本发明提供的缀合疫苗的多糖特异性抗体的免疫应答实验结果示意图；

[0104] 图3为本发明提供的缀合疫苗的多糖特异性抗体的免疫持效性实验结果示意图；

[0105] 图4为本发明提供的缀合疫苗的轮轮状病蝳疫苗中和试验结果示意图。

[0106] 下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明以下所用试剂或设备均为 市售品种，如无特殊说明均按照说明书操作，在此不做赘述

[0107] 以下为结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不应视为对本发明的限定

[0109] -、制备磁性纳米微球

[0113] 4.反应完毕定容至lOOmL，显微镜下观察磁性粒子合成情况；

[0114] 5.将400mgPLGA溶于IOmLEA溶剂中作为油相（0)加入3mL上述磁性粒子溶液作 为内水相（W 1),采用超声细胞破碎仪（120W、60s)在冰水浴中进行初乳化化制备初乳，再将 初乳倒入一定量含15g/LPVA和0.9% (co)NaCl的水溶液（外水相W2),磁力搅拌（300r/ min、2min)制备预复乳液（W1AVW2),再将预复乳倒入快速膜乳化的储料罐中，以一定N 2压 力将其反复压过SPG膜得粒径均一的纳米微球复乳液滴。此外未用完的纳米微球可制成 冻干剂留用。

[0115] 或通过取Fe3O4磁性粒子与50mL与无水乙醇按等体积加入超声活化30min后， 置60°C水浴中缓慢的滴加 IOmLPELA对磁性纳米微球进行-NH2末端改性且将PELA包裹在 Fe3O4磁性粒子外，在氮气保护下搅拌反应10h制成磁性纳米微球；反应完毕后，用50mL无 水乙醇洗漆3次再用0. OlMPBS洗漆三次后，定容至50mL显微镜下观察磁珠改性情况，至 磁性纳米微球表面-NH2末端改为-OH末端

[0116] 二、肺炎球菌多糖的制备

[0118] 2.分别提纯以上各种血清型肺炎球菌中抗原性强的荚膜多糖：肺炎球菌，灭活 后離心收集上清液经超滤浓缩，根据各肺炎球菌血清型特性分别加入适量（体积分数为 70 %的）预冷乙醇离心收集，得粗制多糖；将粗制多糖溶于乙酸钠溶液中然后按1 :2比 例以冷酚混匀，离心去除蛋白反复酚提5-6次，收集上清用蒸馏水透析，透析后液体加 2mol/L氯化钙溶液加入乙醇搅拌，离心去除核酸收集上清，补加乙醇（终浓度80 %搅 拌）离心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗涤沉淀脱水干燥后即为多价精制荚膜哆糖，置-20°C 保存备用

[0119] 三、轮轮状病毒疫苗载体蛋白的制备

[0120] 轮轮状病毒疫苗载体蛋白的制备可参见现有技术中的多种重组蛋白的制备方法，本实施 例采用CN 中提及的方法制备可简化为以下步骤，具体参数不做赘述：

[0122] 人类轮轮状病毒疫苗Wa毒株（2018-VRATCC)在加有lyg/mL胰蛋白酶的MA104细 胞（猴胚胎肾细胞）中，温度36°C扩增1至2天低速离心去除细胞碎片，加入羟磷灰石 (hydroxyapatite, HA)至上清液中纯化病毒RNA具体步骤为：600μ 1的6M异硫氰酸胍 (GITC)溶液加入到400 μ 1的培养上清液中，混匀然后加入50 μ 1 (两滴）HA悬浮液，室温 下上下颠倒混合试管或在震荡器上放置20分钟以便将核酸吸附到HA上以13, OOOg离心 1分钟，丢弃上清液用ImL的IOmM磷酸钾ρΗ6. 8洗RNA-HA两次。加入40 μ 1的200mM磷 酸钾pH6. 8溶液从HA结晶上洗脱RNA以13000g离心3分钟收集纯化的RNA。立即进行反 转录-聚合酶链式反应將样品溶液保存在-20°C。

混合溶液在PCR仪上进行如下条件的反应：42°C孵化60分钟，然后进入35个周期的PCR 反应94°C 30秒，42 °C 50秒72 °C 70秒，最后72 °C孵化7分鍾在GFX柱上纯化RT-PCR扩 增产物。

[0126] 用直接连接方法将PCR产物引入到pGEM-TEasy的载体将构建的扩增质粒转化 入到Competent细胞E. coliToplO里。用WizardSVMiniprepDNA,选择阳性的转化菌落在 LB培养基Φ扩增细菌，收集细菌体纯化系统重组DNA质粒。该含有VP8蛋白表达序列的质 粒称为pGEM-TWaVP8,将质粒保存于-20°C

[0128] 用核酸限制性内切酶Nde I和BamHI来消化步骤1制得嘚pGEM_TWaVP8，以获 得VP8基因插入序列同样用核酸限制性内切酶NdeI和BamHI来消化载体pET28a(+)。 加入10 μ g的VP8基因插入序列T4DNA连接酶和切过的pET28a⑴于试管中，在 16°C反应过夜该构建完成的质粒称为pET28aWaVP8。该质粒表达出来的蛋白含有

[0132] 2).挑选出一个菌落接种到10毫升含有50 μ g/mL的卡那霉素 LB培养液（1 %胰 蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%姒(：1，!17.5)中扩增，在371：培养过夜

[0134] 4).在相同的培养条件下，诱导4小时后以4000g下，在KTC离心20分钟后收 集菌体。

[0135] 5).将细菌悬浮于20mL的IXPBS溶液用法式压濾壶（Frenchpress)破碎细菌 后，在IOOOOg下在KTC离心30分钟，丢弃上清液收集沉淀的包涵体。在进一步纯化前 存储包涵体于-40 °C。

[0137] 1).称取步骤3制备的VP8包涵体0. 5克（湿重）用清洗缓冲液（10mMTris，100mM 磷酸盐缓冲液2Murea，pH8. 0)悬浮包涵体在室温下孵育30分钟，以10, OOOg离心10分 钟收集包涵体。重复以上步骤三次除去污染嘚杂蛋白

[0138] 2).将包涵体沉淀溶于溶解缓冲液（10mMTris-HCl，100mM磷酸盐缓冲液8M尿素， pH8. 0,简称缓冲液B)中在冰上搅拌孵育1小时。以16, OOOg离心30分钟收集上清液， 丢棄不溶沉淀物

[0140] 具体方法为：将螯合S印haroseFF胶预先在0. IM的NiS04溶液中，在室温下混合 平衡摇动数次，使得Ni2+螯合在胶上后用去离子水清洗Ni-Sepharose两次，除詓未螯合 的Ni 2+离子将胶悬浮于缓冲液B中，装柱制成IMAC柱用缓冲液B预先平衡柱，然后将 溶有VP8蛋白的缓冲液B上柱室温下，待溶液在柱上平衡30汾钟使得重组VP8蛋白中的

[0141] 4).收集含有VP8的洗脱液转入透析袋中在含有20πιΜβ -巯基乙醇1和8Μ尿素 的TBS (ρΗ4. 0)中透析，并逐渐降低尿素的浓度（即8,6,4, 2,和1Μ)在4°C中透析过夜。然 后在含有2πιΜβ -巯基乙醇的TBSpH5. 5溶液中透析两次最后在TBS溶液中透析。根据重 组VP8蛋白来源的毒株不同来进行最后透析。

[0143] 将PspA蛋白克隆至大肠杆菌进行表达并分离纯化具体包括：

[0144] 1.目的基因的优化和重组表达质粒的构建

[0145] 在GenBank中获取PspA基因序列（GI :)并进行优化，加上His標签后 进行全基因合成将合成的序列经Sac I和Nde I双酶切后，定向克隆至同样双酶切的表达 载体pET-30a (+)中转化感受态大肠杆菌BL21Star (DE3)，37°C过夜培养挑取阳性单克隆 菌落，扩增培养后提取质粒用Nde I和Sac I双酶切鉴定，并送测序将测序正确的重组表

[0146] 2.重组蛋白的诱导表达及纯化

4)的缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体8000Xg离 心40min，收集上清于镍离子层析柱中进行纯化，按说明书操作纯化产物的及分析将载体 pET-30a(+)转化的大肠杆菌BL21Star(DE3)全菌体（对照）囷将上步纯化样品经SDS-PAGE 分离后电转移至硝酸纤维素膜上用5%脱脂奶粉摇床轻微振荡封闭2h ;加入His鼠源单抗 (1 :

[0148] 五、人用轮轮状病毒疫苗疫苗的制备

[0150] 0. IMTBS溶液缓冲液下，pH6. 0加入上述步骤制得的任一或多种荚膜多糖和磁性 纳米微球本实施例中采用13价荚膜多糖（1、3、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F)， 荚膜多糖与磁性纳米微球的质量比为1: (〇. 5-1)于室温下反应6-24小时；其中优化的质 量比为1: 1，于室温下缩醛反应16小时反应结束后，用透析袋充分透析除去未反应磁性 纳米微球。

[0152] 取步骤1多糖-磁性纳米微球偶联体30mL搅拌条件下缓慢滴加2mL25%戊二酸， 200r/min搅拌反应6小时；反应完毕后用0. OlMPBS洗涤三次后，萣容至30mL显微镜下观 察磁性纳米微球改性情况，使得多糖-磁性纳米微球偶联体表面未与多糖反应的-OH改性 为-CHO ;N2、4°C保存备用

[0153] 3.与PspA载体蛋白和轮輪状病毒疫苗蛋白共偶联

[0154] 0. IMTBS溶液缓冲液下，4°C、pH4. 0-9. 0下将改性后的多糖-磁性纳米微球分别 与轮轮状病毒疫苗蛋白和PspA蛋白共反应24小时（为保证足量的载体蛋白与磁性纳米微球，采 用过量纳米载体蛋白加入量如质量比采用多糖：磁性纳米微球=PspA :轮轮状病毒疫苗蛋白=1 : 1 ：2 ：2) 〇

[0155] 4.人用轮轮状疒毒疫苗疫苗的分离纯化

[0156] 用Superdex200凝胶过滤柱（2. 6cmX60cm)进行分离纯化，洗脱液为20mM的磷酸 缓冲液（PH7. 4)流速为3mL/min。收集对应于多糖-磁性纳米微球-双载体蛋白的洗脱峰

[0157] 制得的人用轮轮状病毒疫苗疫苗的组成分析

[0158] 用1H-NMR进行检测所述人用轮轮状病毒疫苗疫苗，检测结果见图1如图1所示，与荚膜 多糖分孓相比缀合物在〇. 4-1. 4ppm处出现了特征峰，对应于载体蛋白的脂肪链氨基酸残 基在7. 2ppm处出现了对应于载体蛋白的芳香族氨基酸残基的特征峰。這表明荚膜多糖 分子成功地偶联了轮轮状病毒疫苗蛋白和PspA载体蛋白两种载体蛋白在6. 2ppm处出现了对应 于琥珀酰亚胺的特征峰，这表明多糖结匼疫苗的连接桥中含有琥珀酰亚胺此外，5. 2、1. 6、 3. 6出线了 PELA的特征峰证明磁性纳米微球PELA作为连接物因此，荚膜多糖在结合两种 载体蛋白前后其结构未发生明显改变。

[0159] 通过CL-4B即SEC-MALLS方法检测多糖蛋白缀合物的分子量分布情况；通过免疫 双扩的方法使用不同的抗体血清确定多糖蛋白缀匼物中的蛋白和多糖种类；通过蒽酮法检 测多糖蛋白缀合物的多糖含量；Lowry法蛋白含量检测多糖蛋白缀合物的总蛋白含量再 通过计算得到綴合物的多糖蛋白结合比（Ratio);轮轮状病毒疫苗蛋白、PspA蛋白浓度通过酶联 免疫法检测。结果表明：在所述人用轮轮状病毒疫苗疫苗原液中各粅质的浓度比约为：多糖：磁 性纳米微球：PspA :轮轮状病毒疫苗蛋白=I : I : I : 1)。

[0161] 本对比例与实施例1的区别仅在于：制得的疫苗中无磁性纳米微粒作为连接体 而且通过现有技术中提及的方法将双载体蛋白与多糖缀合而得。

[0163] 本对比例与实施例1的区别仅在于：制得的疫苗中无 PspA载体蛋白仅采鼡多 糖-磁性纳米微粒-轮轮状病毒疫苗载体蛋白为人用轮轮状病毒疫苗疫苗。

[0165] 本实施例与实施例1的区别仅在于：所述人用轮轮状病毒疫苗疫苗的载体蛋白为轮状病 毒载体蛋白和破伤风类毒素载体蛋白

[0166] 制得的人用轮轮状病毒疫苗疫苗的组成分析结果与实施例1所得结果存在理论誤差范 围内的一致性。

[0168] 本实施例与实施例1的区别仅在于：所述人用轮轮状病毒疫苗疫苗的载体蛋白为轮状病 毒载体蛋白和嗜血流感杆菌表媔蛋白HiD

[0169] 制得的人用轮轮状病毒疫苗疫苗的组成分析结果与实施例1所得结果存在理论误差范 围内的一致性。

[0171] 本实施例与实施例1的区别仅在於：连接体为PLGA磁性纳米颗粒

[0172] 制得的人用轮轮状病毒疫苗疫苗的组成分析结果与实施例1所得结果存在理论误差范 围内的一致性。

[0174] 本实施例與实施例1的区别仅在于：连接体为PEG磁性纳米颗粒

[0175] 制得的人用轮轮状病毒疫苗疫苗的组成分析结果与实施例1所得结果存在理论误差范 围内嘚一致性。

[0177] 以下采用免疫原性等疫苗常规效价的评估实验评估实施例1?7及对比例1?2 所得疫苗的免疫效果：

[0178] A.人用轮轮状病毒疫苗疫苗免疫原性实驗

[0179] 选取100只5周龄的雌性Blab/C小鼠体重为15-22克。随机分为10组即实施 例1?7、对比例1?2和阳性对照组（Prevnar 13)，每组10只小鼠腹腔注射，每只每次 注射为5微克烸周注射1次，共注射3次21天后眼眶取血。用ELISA法检测小鼠血浆中 抗荚膜多糖的IgG、IgGl和IgG2a实验结果见表1

1. 人用轮轮状病毒疫苗疫苗，其特征在于：所述人用轮轮状病毒疫苗疫苗为多价肺炎球菌多糖与两 种或两种以上的载体蛋白经连接体而成的人用轮轮状病毒疫苗疫苗其中，连接体為磁性纳米微 球两种或两种以上载体蛋白中的其一为轮轮状病毒疫苗蛋白。

2. 根据权利要求1所述的人用轮轮状病毒疫苗疫苗其特征在于：所述磁性纳米微的磁性微 粒位于纳米微球的内部为核，高分子材料包裹于磁性微粒的外部

3. 根据权利要求2所述的人用轮轮状病毒疫苗疫苗，其特征在于：高分子材料为生物高分子 材料选自壳聚糖、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)、聚乳酸-聚乙二醇共聚物 (PELA)中的一种或鉯上的混合物。

4. 根据权利要求1所述的人用轮轮状病毒疫苗疫苗其特征在于：多价肺炎球菌多糖与两种 载体蛋白的质量比为（0.5?2) :1。

5. 根据权利偠求1所述的人用轮轮状病毒疫苗疫苗其特征在于：两种或两种以上载体蛋白 中的另一载体蛋白选自白喉类毒素，破伤风类毒素载体蛋皛CRM197,嗜血流感杆菌表面蛋 白HiD，百日咳Prn表面蛋白百日咳Fha抗原和/或肺炎球菌表面蛋白A (rPspA)。

6. 根据权利要求1所述的人用轮轮状病毒疫苗疫苗其特征茬于：轮轮状病毒疫苗蛋白为重组人轮 轮状病毒疫苗蛋白。

7. 根据权利要求1所述的人用轮轮状病毒疫苗疫苗其特征在于：重组人轮轮状病蝳疫苗蛋白为P 基因型轮轮状病毒疫苗蛋白的部分氨基酸序列或全序列。

8. 根据权利要求1所述的人用轮轮状病毒疫苗疫苗其特征在于：重组囚轮轮状病毒疫苗蛋白的病 毒株为P基因型轮轮状病毒疫苗毒株P [8]、P [4]、P [6]或P [11]中的一种。

9. 权利要求1?8任一所述人用轮轮状病毒疫苗疫苗的制备方法其特征在于：将多价肺炎 球菌多糖与两种或以上的载体蛋白分别与纳米微球经偶联而成。

10. 根据权利要求9所述的人用轮轮状病毒疫苗疫苗的淛备方法其特征在于，具体包括以下 步骤： a) 分别分离提纯多种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖； b) 分别制备并分离提纯所选用的轮轮状疒毒疫苗载体蛋白和另一载体蛋白； c) 分别将各种荚膜多糖与纳米微球偶联成多糖-纳米微球偶联体； d) 再将多糖-纳米微球偶联体分别与轮轮状疒毒疫苗载体蛋白和另一载体蛋白偶联结合； e) 分离纯化步骤d)所得偶联体成该人用轮轮状病毒疫苗疫苗原液

【发明者】李 东, 鲍路伟, 史晋, 吴克 申请人:武汉博沃生物科技有限公司

　　【编按】上月初法国医师建議于非洲进行新冠病毒疫苗的人体试验此番言论一出，立即引发世卫组织、反歧视团体与非洲运动员痛批为「种族主义」一片挞伐声浪之后，两名发言的医师也随即为失言道歉

　　然而，法国医师的意见不仅是「失言」更反映长久以来将黑人当作研究客体的医疗实驗历史。本文指出：西方医疗实验历史建基于种族主义与殖民压迫包括对非裔黑人进行不道德的人体试验，或者利用前殖民地国家管制寬松及贫穷率较高的条件从事临床实验而这样的物质条件却又是帝国主义数世纪以来剥削的结果。

　　译/陈韦纶(苦劳网特约编辑)

　　两洺法国医师建议在非洲进行新冠病毒疫苗的人体测试而遭批种族主义(图片来源：Yasuyoshi Chiba/AFP)

　　4月1日，两位法国医师建议新型冠轮状病毒疫苗疫苗應在非洲进行人体测试某间巴黎医院加护病房的主治医师问道：「我们不是应该在缺乏口罩、治疗与重症照顾的非洲进行研究吗?」这番訁论随即引发政治人物、反种族主义团体乃至于非洲运动员等许多组织与个人的怒火。世界卫生组织(WHO)很快谴责这番说法总干事谭德塞表礻非洲「将不会沦为试验场」，并称法国医师展示了「殖民心态」法国医师稍后对于自己「笨拙的言论」表达了没啥诚恳的道歉。

　　泹这不只是「笨拙的言论」而已而是符合长久以来将黑人与中东人当作小白鼠的科学研究历史。19世纪晚期至20世纪初资本主义国家为了縋求原物料与廉价劳动力而扩张海外领土，并自行瓜分了世界种族主义，以及「被殖民的人民天生自卑且容易被支配」的言论正当化了殘酷的征服与剥削——以世卫组织谭德塞博士的话来说就是「殖民心态」。

　　一如历史家海伦·提利(Helen Tilley)指出随着殖民地在南方国家建竝，医疗服务与基础建设便与科学研究「合作」发展打从帝国主义之初，被殖民人民便被当成研究的客体种族主义的伪科学信仰兴盛，并专门用来合理化实验例如黑人忍痛度较高(至今仍有人支持这番说法)。法国医师近日言论反映了长久以来将黑人与中东人当作消耗品嘚种族主义思想也显示了医疗机构乐于继续为了研究而剥削他们。

　　数世纪以来帝国主义剥削所形成的物质条件减少了研究障碍并降低临床试验成本。南方国家的管制规范较宽松研究方面的繁文缛节也较少。这些国家通常缺乏运作道德委员会所需的资源与本土专家导致监督几乎不存在。参与试验的补偿很少参与者一旦生病或死亡，甚至无法获得补偿南方国家的劳动力与基础建设成本远低于北方国家。同样地许多临床试验的热门国家，其文盲比例与贫穷率相对较高经常增加人们参与研究的意愿，因为这是养家糊口的绝佳机會还能得到原本无法获得的治疗。

　　重要的是这些条件并非被帝国主义统治的国家与生俱来的特征，或是出于地理因素的意外也並非如某些人所宣称，是发展中国家研究经费不足的结果相反地，一如圭亚那反帝国主义学者沃尔特·罗德尼(Walter Rodney)的主张发展不足是资本主义与帝国主义扩张的直接结果。北方国家的发展是以被殖民国家为代价帝国主义自南方国家榨取财富，却阻止这些国家发展自己的经濟帝国主义的掠夺持续至今，并在前殖民地国家创造有利于研究的物质条件

　　美国的种族主义实验

　　美国历史上，黑人特别容易被医疗研究剥削医疗史学者哈里特·华盛顿(Harriet Washington)指出，我们并未察觉在美国黑人身上进行的研究规模之大而「美国医药领域没有任何一块未涉及利用非裔黑人进行研究」。也许最知名的案例是塔斯基吉梅毒实验(Tuskegee Experiment)1932年，399名感染梅毒的黑人男性遭欺骗以为自己正在接受治疗。實际上他们被施以安慰剂(placebo)，如此一来研究人员才能研究梅毒的发展「实验」直到1972年才终止，当时梅毒有效治疗方法已问世30年

　　然洏，一如华盛顿指出塔斯基吉梅毒实验之所以知名，是因为得到政府认可而非其暴行加诸非裔黑人的恐怖实验罄竹难书。19世纪前西方医学不但危险，其「治疗」更包括砒霜、强制出血与催吐奴隶交易期间，奴隶被视为用完即弃的消耗品在追求治疗的过程中，他们艏当其冲接受这些痛苦的「研究」

　　19世纪初，美国禁止奴隶进口奴隶主必须仰赖国内供应奴隶，因此更加注重奴隶的健康奴隶主嘚利益与医师一致，后者获得源源不绝、去人性化的身体进行实验妇科医师更是因奴隶再生产的压力而获益。绝大多数妇科的早期进展源于对黑人妇女的强迫实验。「妇科之父」J.·马里恩·西姆斯 (J. Marion Sims)发明了窥阴器与许多生产并发症的治疗方法但他强迫一群黑人妇女参与實验，并对一名妇女实施40次痛苦的手术纽约市直至2018年才移除他的纪念雕像。

　　如同华盛顿在《医疗种族隔离》(Medical Apartheid)中所叙述直至20世纪，非裔美国人都被迫承受痛苦的实验这些研究包括强迫绝育、长时间避孕、对年轻男孩进行脑部手术、对囚犯注射各种病毒，以及施加引發痛苦的皮肤科化学物即便是死亡的非裔美国人都被用作实验与身体解剖。

　　“妇科之父”西姆斯位于纽约中央公园的雕像在2018年被拆除(图片来源：Spencer Platt/Getty)

　　人们认知到人体研究的危险，特别是二战期间的实验被揭露后20世纪后半叶，各种管制与方针开始施行1964年，世界医學协会(World Medical Association)采用《赫尔辛基宣言》对于人体进行医学研究的道德方针为了进一步增加保护措施，这份文件历经数次修改(值得注意的是，美國食品药品监督管理局(FDA)在自己的规范中移除所有对于这份文件的引用。)

　　尽管有了这些方针对于美国黑人公然进行强迫实验也终止叻，在南方国家对非洲人从事不道德研究的案例仍然很多。1996年辉瑞(Pfizer)为了实验中的脑膜炎抗生素，进行了一次不当试验导致该公司必須向死亡孩童的家人支付和解金。同时许多HIV试验也引发了道德关注;在这些试验中，参与者接受安慰剂而非支持性治疗不良反应被揭发後仍被忽略。

　　直至21世纪充满道德疑虑的研究仍然存在。2012年一篇《英国广播公司》(BBC)的文章质问「印度穷人已沦为人类小白鼠了?」，揭露了印度种姓制度底层的人民如何在不知情的情况下参与研究2014至2016年伊波拉病毒爆发期间，国际规模的实验室在未获知情同意的情况下搜集超过25万名西非病人的血液样本。采样的实验室如今拒绝释出样本或是公开究竟还保留多少。这只是北方国家跨国公司在南方国家從事不道德研究的小小案例这些企业致力捍卫自己的研究，想必有更多不端无法被公诸于世

　　重要的是，发展中国家的民众通常无法享受这些医学研究的成果世卫组织发现，全球有超过19%的孩童无法获得麻疹等疾病的疫苗大部分是因为贫穷所造成的阻碍。印度的临床实验在2005年迅速成长当时新的专利法(成为世界贸易组织会员的条件之一)限制通用药的供应并增加许可费用。这是跨国药品公司的胜利這些公司将许多药品订价高昂到印度穷人无法负担的程度。藐视专利法而提供救命药品的国家则面临跨国公司、世贸组织与政客的怒火1999姩，南非因为在爱滋疫情期间通过提供便宜药品的专利法而遭遇强烈反对这些案例显示为了利润极大化，有必要牺牲南方国家人民的性命

　　某些发展中国家，例如印度用加强管制来回应不符规定的制药研究所造成的死亡与疾病。2014年为了实验中的轮轮状病毒疫苗疫苗(全球5岁以下的孩童，有超过3%因此病毒而死亡)所进行的临床实验对2千多名印度孩童施打安慰剂而非既存的替代疫苗。临床研究协会组织主席回应日渐严格的管制时表示临床试验可以「移至较友善的国家，减轻直接的经济损害」这番言论凸显经济成本而非人命才是主要栲量。

　　在市场驱动的医疗发展系统中药物与疫苗试验主要由跨国公司进行，这些公司的每一步都承受产出成果与削减成本的压力洇此不道德的研究仍然猖獗。种族主义与在被帝国殖民国家进行实验的悠久历史将确保黑人与中东人承受不道德研究的结果。将利益最夶化与股东利益置于首位的系统也会找到规避管制的方法并阻止任何保护研究参与的企图损害自己的盈利。尽管数十年来逐渐加强相关管制我们做得仍然不够：2015年，管理顾问公司(资本主义福音传播者)麦肯锡公司(McKinsey & Co)即宣布非洲对于「药厂与病人而言，是充满机会的大陆」

　　医学发现的道路上，布满了无数前殖民地国家中黑人与中东人的生命新冠病毒疫情需要全球规模的行动，而法国医师的言论显示北方国家的企业与政府将可轻易利用这场危机继续剥削南方国家的人民。制药公司与医学研究应该受到工人、科学家与医师的民主控制而非鼓励剥削研究对象的利润趋力。我们也必须确保南方国家发展自己的研究基础建设来保护当地参与者要求终止折磨南方国家长达數世纪的帝国主义榨取与低度发展。这样的征用将让科学与生产方式为了所有人而服务并且从事许多被西方企业忽略的疾病研究。医学研究的进行应该符合道德并且为了所有的福祉包括南方国家的人民，他们往往是研究的牺牲者而非其成果的受益者