鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的研制--《山西农业大学》2014年硕士论文
鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的研制
【摘要】：2010年4月,我国南方部分地区爆发了一种以蛋鸭产蛋量下降为主要特征的传染病。该病由坦布苏病毒(Tembusu virus, TMUV)所引起,因此称为鸭坦布苏病毒病(DuckTembusu virusdisease)。鸭坦布苏病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)恩塔亚病毒群(Ntaya virus group)。鸭坦布苏病毒病传播迅速,危害严重,自2010年在我国首次发生以来,给我国养鸭产业造成了巨大的经济损失。目前,迫切需要一种安全有效的疫苗来预防和控制该病的发生和流行。
鸭坦布苏病毒弱毒株(FXP株)是由鸭坦布苏病毒强毒株(FX2010株)在鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts, CEFs)上连续传代培养而获得。本研究利用鸭坦布苏病毒弱毒(FXP株)作为种子毒,开展了鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的研究。首先,进行了鸭坦布苏病毒病灭活疫苗生产工艺的研究。本研究使用异步接毒方法对最佳接毒量和收毒时间进行了优化。结果显示,用105.5TCID50病毒接种T75细胞培养瓶中长成单层的DF-1细胞并在第60h收毒,病毒滴度可稳定在106.0TCID50/0.1ml左右。在此条件下把病毒进行扩大培养,并选用甲醛和p-丙内酯(BPL)两种灭活剂灭活病毒,结果显示,2‰的甲醛和BPL均能完全灭活病毒。把佐剂Montanide ISA50V2以100r/min低速预乳化后,滴加等体积的灭活病毒液,然后以6000r/min乳化5min制备灭活疫苗,该制剂为油包水型乳白色乳剂,3000r/min离心15min,不破乳,稳定性良好。按照上述生产工艺制备鸭坦布苏病毒灭活疫苗进行后续的研究。
为研究不同灭活剂以及抗原含量对鸭坦布苏病毒病灭活疫苗免疫效果的影响,本研究把病毒液用甲醛、BPL两种灭活剂灭活后,用离心过滤管进行浓缩,然后用不同抗原含量(分别相当于1倍、2.5倍、5倍和10倍量的病毒原液)的病毒浓缩液制备灭活疫苗并免疫21周龄母鸭。在免疫后第1、2和3周分别采集血清,用阻断ELISA检测抗体效价。结果显示,抗原含量高的疫苗诱导产生抗体时间较早,抗体滴度也较高。第3周用103.5TCID50的强毒攻击免疫鸭,通过临床症状、病理变化以及对脾、肺、肾、脑、卵巢等样本的病毒分离结果来评价疫苗的免疫效力。结果显示,疫苗的抗原含量与保护效力具有明显相关性。另外,与甲醛相比,用p-丙内酯(BPL)作为灭活剂制备的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的免疫效力更好。
上述研究显示,提高抗原含量有利于提高灭活疫苗的免疫效力,但用浓缩技术提高抗原含量会显著增加疫苗的生产成本,而且,灭活疫苗单次免疫抗体效价离散度较高。鉴于此,本研究进一步评价了用BPL灭活的病毒液制备的灭活疫苗两次免疫鸭的免疫效力。结果显示,含1倍抗原量和2倍抗原量的灭活疫苗两次免疫诱导的抗体水平相当,强毒攻击后,两组免疫鸭都获得100%保护。
【关键词】：
【学位授予单位】：山西农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：S859.79【目录】：
摘要7-9前言9-19 1 鸭坦布苏病毒病概述9-15
1.1 病原学9-11
1.1.1 形态结构9
1.1.2 基因结构特点9-10
1.1.3 结构蛋白与功能10-11
1.1.4 在宿主细胞内的复制11
1.2 临床症状11-12
1.3 病理变化12
1.4 流行病学12-13
1.5 实验室诊断方法13-15
1.5.1 病毒分离法13
1.5.2 血清学检测13-14
1.5.3 分子生物学诊断方法14-15 2 疫苗15-18
2.1 疫苗类型15-16
2.2 常用灭活剂16-17
2.3 佐剂17-18
2.3.1 铝佐剂17-18
2.3.2 脂质体佐剂18
2.3.3 油包水乳剂18 3 本研究的目的和意义18-19试验一 鸭坦布苏病毒病灭活疫苗生产工艺的研究19-26 1 试验材料19-20
1.1 病毒和细胞,试验动物19
1.2 主要试剂19
1.3 主要仪器19-20 2. 试验方法20-22
2.1 病毒在DF-1细胞上的增殖特性20-21
2.1.1 病毒在DF-1细胞上的培养20
2.1.2 同步和异步接毒方法比较20
2.1.3 接毒量与收毒时间的优化20-21
2.2 病毒细胞半数感染量(TCID_(50))的测定21
2.3 灭活疫苗的制备21-22
2.3.1 扩增病毒液21
2.3.2 病毒液灭活21-22
2.3.3 病毒灭活效果检测22
2.3.4 疫苗乳化和物理性状检测22 3 结果22-24
3.1 病毒在细胞上增殖特点22-24
3.1.1 病毒在DF-1细胞上的增殖22-23
3.1.2 同步与异步接毒法比较结果23
3.1.3 生长曲线绘制23-24
3.2 病毒液灭活效果检测24
3.3 乳化试验检测结果24 4 分析与讨论24-26试验二 抗原含量对鸭坦布苏病毒病灭活疫苗免疫效力的影响26-34 1 试验材料26-27
1.1 病毒,细胞和试验动物26
1.2 主要试剂26
1.3 主要仪器26-27 2. 试验方法27-29
2.1 灭活疫苗的制备27
2.2 免疫与攻毒试验27-28
2.3 免疫后血清抗体效价检测28
2.4 病毒分离28-29 3 结果29-32
3.1 免疫后抗体水平检测结果29-30
3.2 攻毒保护试验结果30-32
3.2.1 临床表现30-31
3.2.2 剖检病变31
3.2.3 病毒分离试验结果31-32 4 分析与讨论32-34试验三 鸭坦布苏病毒病灭活疫苗两次免疫鸭的免疫效力评价34-41 1 材料与仪器34-35
1.1 病毒和细胞、试验动物34
1.2 主要试剂和仪器34
1.3 引物名称和序列34-35 2 方法35-37
2.1 灭活疫苗的制备35
2.2 免疫与攻毒试验35-36
2.3 免疫后血清抗体效价检测36
2.4 病毒分离试验36
2.5 荧光定量PCR方法检测DTMUV在鸭脏器中的含量36-37
2.5.1 抽取病毒RNA36
2.5.2 cDNA的合成36-37
2.5.3 荧光定量PCR检测病毒核酸37 3 结果37-40
3.1 鸭血清抗体效价检测结果37-38
3.2 攻毒保护效果评估38-40
3.2.1 临床表现38
3.2.2 剖检病变38
3.2.3 病毒分离试验结果38-39
3.2.4 荧光定量PCR检测鸭各脏器病毒含量结果39-40 4 分析与讨论40-41全文结论41-42参考文献42-45Abstract45-47附录47-49在读期间发表论文49-51致谢51
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京公网安备74号H9N2亚型禽流感病毒与鸭坦布苏病毒的生物学特性研究及疫苗的初步研制--《内蒙古农业大学》2012年博士论文
H9N2亚型禽流感病毒与鸭坦布苏病毒的生物学特性研究及疫苗的初步研制
【摘要】：H9N2亚型禽流感病毒在全世界流行广泛,危害巨大。通常该亚型禽流感病毒为低致病性,感染禽类后不会引起大批死亡。但最近发现感染该亚型病毒的禽类死亡率很高,应用多聚酶链式反应(PCR)方法诊断,发现感染本病禽类脏器中同时存在H9N2亚型禽流感病毒和新发现的鸭坦布苏病毒。基于此问题,本研究分别对H9N2亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒的生物学特性进行了深入研究,并对预防这两种病毒的疫苗进行了初步探讨研究。
为掌握我国H9N2亚型禽流感病毒流行株的生物学特性,本研究选取年分离到的27株病毒进行了系统深入的研究。遗传演化分析发现我国H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化复杂,部分毒株PA和NS基因与H9N2亚型禽流感病毒参考序列的同源性均不高,表明这些基因可能来源于其它亚型的流感毒株,序列分析发现H9N2亚型禽流感病毒近期分离株的基因片段主要起源于Ck/Shanghai/F/98(H9N2)株。交叉血凝抑制实验及病毒中和实验表明近年来我国H9N2亚型禽流感病毒的抗原性发生了明显的改变。对BALB/c小鼠致病性实验说明我国H9N2亚型禽流感病毒对小鼠的致病能力呈现下降趋势,尤其是2006年后的病毒分离株在小鼠体内的复制能力明显低于早期分离株。挑取处在不同进化分支的4株H9N2亚型禽流感病毒对4周龄SPF鸡进行了鼻腔接种致病性实验,发现这些毒株主要在感染鸡的气管和肺脏中增殖,但不出现明显症状。
根据上述抗原性分析结果,从H9N2亚型禽流感病毒分离株中筛选出一株病毒Ck/Shanghai/441/09(H9N2)(简称Ck441)进行了初步的疫苗(免疫学)研究。Ck441病毒尿囊液灭活后制备灭活(毒株)疫苗,免疫4周龄SPF鸡,免疫3周后,用Ck441和一株2011年H9N2亚型禽流感病毒分离株进行攻毒实验,发现免疫组鸡均不发病、不排毒,而对照组鸡100%排毒,表明Ck441是一株理想的疫苗候选株。为提高病毒株的在细胞上的增殖能力,把Ck441的HA和NA插入到pBD载体SapI酶切位点之间,分别拯救获得了4株重组病毒,通过鸡胚和细胞增殖实验,发现441HANA/PR8-mutNS在鸡胚和细胞上增殖滴度都很高,将该株病毒经鸡胚和细胞扩增、灭活后制备灭活疫苗并免疫SPF鸡,都能够达到100%的保护率。
鸭坦布苏病毒是2010年4月以来引起鸭产蛋量下降、生长阻滞甚至死亡的新发鸭传染性疾病的病原,为获得此病毒对哺乳动物和鸡的致病信息,将鸭坦布苏病毒奉贤分离株(FX2010)人工感染BALB/c小鼠和SPF鸡。经肌肉和腹腔注射接种小鼠,各组织脏器均没检测到病毒；经鼻腔接种小鼠,FX2010病毒可在BALB/c小鼠的肺脏中复制增殖；脑内接种,BALB/c小鼠出现明显的临床症状,被毛逆立,体重下降,在小鼠的脑和肺脏中均可分离到病毒,随着接种病毒量的增加,小鼠体重下降更加明显；经8d后,脑内病毒含量仍然很高,而肺脏中的病毒含量明显降低。FX2010经肌肉和鼻腔接种2周龄SPF鸡,经鼻腔接种鸡体重增长明显减缓,肌肉接种体重变化与对照组无明显差异。病毒分离发现,经鼻腔和肌肉接毒的鸡在多个脏器均可分离到病毒；FX2010病毒经鼻腔接SPF产蛋鸡,实验组鸡排出绿色粪便,产蛋量呈现一过性下降,部分脏器能够检测到病毒。在感染鸡的整个实验过程中,未见鸡严重发病或死亡,表明该病毒对鸡呈现低致病性。
为初步研制防控鸭坦布苏病毒病的DNA疫苗,将鸭坦布苏病毒E基因和密码子优化后E基因分别插入到真核表达载体pCAGGS,通过IFA和Western blot实验,证明两种重组质粒在真核细胞内都能表达具有免疫原性的E蛋白,而优化后的重组质粒较野生型的表达量更高。重组疫苗(毒株)质粒免疫小鼠后,用间接ELISA检测两种DNA疫苗免疫小鼠的血清抗体,发现密码子优化后E基因的质粒激发的抗体效价高于未优化质粒,该试验为DNA疫苗防治鸭坦布苏病毒病提供了初步研究数据。
总之,本研究阐明了H9N2亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒的部分生物学特性,初步研制了H9N2亚型禽流感的灭活疫苗和鸭坦布苏病毒病的DNA疫苗质粒。这些研究为H9N2亚型禽流感病毒病和鸭坦布苏病毒病的防治提供坚实的理论依据。
【关键词】：
【学位授予单位】：内蒙古农业大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：S852.65【目录】：
摘要3-5Abstract5-12插图12-13附表清单13-15引言15-40 1 A型流感病毒15-29
1.1 A型流感概述15-16
1.2 流感病毒抵抗力16-17
1.3 流感病毒结构、形态及化学组成17
1.4 流感病毒复制、变异及重组17-18
1.5 流感病毒历史上的爆发与流行18-20
1.6 流感病毒的抗原变异蛋白的结构与功能20-21
1.7 流感病毒抗原变异的分子基础21-23
1.8 流感病毒各蛋白与致病性的关系23-29 2 H9N2型禽流感病毒29-32
2.1 H9N2亚型禽流感病毒的历史29-30
2.2 H9N2亚型禽流感病毒的分子演化30
2.3 H9N2亚型流感病毒在哺乳动物的分离及其“基因池”作用30-31
2.4 H9N2亚型禽流感病毒的增殖31-32 3 流感病毒的疫苗研制32-33
3.1 抗原基因的选择32
3.2 流感疫苗的类型32-33 4 反向遗传操作技术33-35
4.1 定义33-34
4.2 流感反向遗传技术34-35
4.3 流感病毒反向遗传技术应用35 5 鸭坦布苏病毒35-37
5.1 鸭坦布苏病毒概述35
5.2 鸭坦布苏病毒的理化特性35-36
5.3 鸭坦布苏病毒基因组编码蛋白产物及E蛋白的生物学功能与特性36
5.4 鸭坦布苏病毒流行状况及致病特征36-37 6 DNA疫苗研究进展37-39 7 本实验研究的目的和意义39-40第一部分 H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及抗原性分析40-53 1 材料与方法40-43
1.1 实验用H9N2亚型禽流感病毒40
1.2 SPF鸡胚、SPF鸡及其它40
1.3 H9N2亚型禽流感病毒的鉴定方法40-41
1.4 实验用H9N2亚型禽流感病毒的有限稀释法纯化及EID_(50)测定41
1.5 实验用H9N2亚型禽流感病毒阳性血清的制备41
1.6 H9N2亚型禽流感病毒的血凝抑制实验41
1.7 代表抗原性差别“r”值的计算41-42
1.8 H9N2亚型禽流感病毒的中和实验42
1.9 代表血清抑制性差别“R”值的计算42
1.10 H9N2亚型禽流感病毒接毒SPF鸡后病毒在感染鸡脏器的分布实验42-43
1.11 候选疫苗株Ck441(Ck/Shanghai/441/09)对SPF鸡的保护性实验43 2 结果43-51
2.1 27株H9N2亚型禽流感病毒EIDso测定结果43-44
2.2 H9N2亚型禽流感病毒血凝抑制及“r”值计算结果44
2.3 H9N2亚型禽流感病毒中和实验结果44-49
2.4 SPF鸡接毒H9N2亚型禽流感病毒后脏器病毒的分离结果49-50
2.5 候选疫苗株Ck441灭活后对SPF鸡的保护性实验结果50-51 3 讨论与小结51-53第二部分 H9N2亚型禽流感病毒对BALB/c小鼠的致病性研究53-59 1 材料与方法53-54
1.1 实验用毒株53
1.2 实验动物及器械53
1.3 BALB/c小鼠实验操作过程53
1.4 BALB/c小鼠脏器的采集53
1.5 脏器病毒含量的测定53-54 2 结果54-56
2.1 27株H9N2亚型禽流感病毒在BALB/c小鼠脏器的分离结果54-55
2.2 27株H9N2亚型禽流感病毒对BALB/c小鼠的致病性结果55-56 3 讨论与小结56-59第三部分 H9N2亚型禽流感病毒分子进化分析59-87 1 材料与方法59-61
1.1 材料59
1.2 主要试剂与仪器59
1.3 PCR及测序用引物59-60
1.4 病毒RNA的提取60-61
1.5 反转录61
1.6 目的片段的获得61
1.7 核苷酸序列的测定61
1.8 27株H9N2亚型禽流感病毒基因序列的拼接与分析61 2 结果61-83
2.1 参考毒株及基因序列测定结果61-62
2.2 PB2基因比较分析结果62-64
2.3 PB1基因比较分析结果64
2.4 PA基因比较分析结果64-68
2.5 HA基因比较分析结果68-70
2.6 NP基因比较分析结果70-72
2.7 NA基因比较分析结果72-74
2.8 M基因比较分析结果74-75
2.9 NS基因比较分析结果75-82
2.10 27株H9N2亚型禽流感病毒8基因片段的归类结果82-83 3 讨论与小结83-87第四部分 H9N2亚型重组流感病毒的拯救及其生物学特性的研究87-97 1 材料与方法87-90
1.1 病毒及试剂87
1.2 SPF鸡胚和SPF鸡87
1.3 载体及构建质粒87
1.4 用于扩增HA和NA基因用引物87-88
1.5 HA和NA片段的扩增88
1.6 PCR产物的凝胶电泳纯化88
1.7 pBD载体和目的片段的酶切处理88
1.8 质粒pBD-441HA和pBD-441NA的构建88
1.9 H9N2亚型重组流感病毒的拯救过程88-89
1.10 拯救重组流感病毒的鉴定89
1.11 4株H9N2亚型重组流感病毒的拯救89
1.12 拯救重组流感病毒的增殖实验89
1.13 H9N2亚型拯救重组流感病毒的SPF鸡免疫及保护性实验89-90
1.13.1 疫苗候选病毒及其属性89-90
1.13.2 疫苗免疫与攻毒保护实验90 2 结果90-91
2.1 pBD-441HA和pBD-441NA重组质粒构建90-91
2.2 4株H9N2亚型重组流感病毒的拯救结果91 2.3 拯救H9N2亚型重组流感病毒的鸡胚增殖实验结果91-92
2.3.1 病毒37℃鸡胚增殖结果91
2.3.2 病毒33℃鸡胚增殖结果91-92 2.4 拯救H9N2亚型重组病毒的细胞增殖实验结果92-94
2.4.1 无TPCK-trypsin的HA-2细胞增殖结果92-93
2.4.2 有TPCK-trypsin的HA-2细胞增殖结果93-94 2.5 SPF鸡免疫及保护性实验结果94-95
2.5.1 灭活疫苗免疫SPF鸡后不同时间激发抗体产生的含量结果94
2.5.2 喉头和泄殖腔病毒分离结果94
2.5.3 攻毒4d后实验鸡脏器的病毒分离结果94-95 3 讨论与小结95-97第五部分 鸭坦布苏病毒对BALB/c小鼠及SPF鸡的致病性研究97-108 1 材料与方法97-99
1.1 病毒97
1.2 实验动物97
1.3 鸭坦布苏病毒对BALB/c小鼠的致病性实验97-98
1.3.1 鸭坦布苏病毒不同接种途径感染BALB/c小鼠实验97
1.3.2 鸭坦布苏病毒脑内接种感染BALB/c小鼠实验97
1.3.3 鸭坦布苏病毒不同稀释度脑内接种感染BALB/c小鼠实验97-98
1.3.4 鸭坦布苏病毒脑内接种感染BALB/c小鼠后不同时间脏器病毒含量实验98
1.4 鸭坦布苏病毒对SPF鸡的致病性实验98-99
1.4.1 鸭坦布苏病毒对2周龄SPF鸡的致病性实验98-99
1.4.2 鸭坦布苏病毒对产蛋SPF鸡的致病性实验99 2 结果99-105
2.1 BALB/c小鼠不同途径接种鸭坦布苏病毒的实验结果99-100
2.1.1 脏器病毒含量的测定结果99
2.1.2 小鼠体重变化99-100
2.2 BALB/c小鼠脑内接种鸭坦布苏病毒的结果100-101
2.2.1 脏器病毒含量的测定结果100-101
2.2.2 小鼠体重变化101
2.3 BALB/c小鼠脑内接种不同稀释度鸭坦布苏病毒后的体重变化101-102
2.4 BALB/c小鼠脑内接种鸭坦布苏病毒后不同时间脏器病毒含量结果102-103
2.5 鸭坦布苏病毒对2周龄SPF鸡致病性实验结果103-104
2.5.1 脏器病毒含量的测定结果103
2.5.2 2周龄SPF鸡的体重增长趋势103-104
2.6 鸭坦布苏病毒对产蛋SPF鸡致病性实验结果104-105
2.6.1 病毒含量的测定结果104
2.6.2 产蛋鸡产蛋量的变化104-105 3 讨论与小结105-108第六部分 鸭坦布苏病毒DNA疫苗的初步研究108-115 1 材料与方法108-110
1.1 病毒108
1.2 质粒、细胞及抗体108
1.3 主要试剂108
1.4 实验动物108
1.5 扩增E基因用引物的设计及合成108
1.6 E基因的密码子优化及合成108-109
1.7 野生型(Wild-type)和优化型(Opti-type)真核表达载体的构建109
1.7.1 野生型真核表达载体的构建109
1.7.2 优化型真核表达载体的构建109
1.8 间接免疫荧光(IFA)检测蛋白的表达109
1.9 Western blot检测蛋白的表达109-110
1.10 疫苗质粒对BALB/c小鼠的免疫110
1.11 间接ELISA检测BALB/c小鼠血清抗体110 2 结果110-113
2.1 E基因的优化及合成结果110
2.2 重组DNA疫苗质粒的构建结果110-111
2.2.1 成功构建野生型DNA疫苗质粒pCAGGS-E110-111
2.2.2 成功构建优化型DNA疫苗质粒pCAGGS-OptiE111
2.3 间接免疫荧光(IFA)检测结果111-112
2.4 Western blot检测结果112
2.5 免疫BALB/c小鼠后不同时间分离血清中抗体的检测结果112-113 3 讨论与小结113-115第七部分 全文结论115-116致谢116-117参考文献117-133附录133-134作者简介134
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中国畜牧兽医报
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中国农科院成功研制“鸭坦布苏病毒病活疫苗”
中国畜牧兽医报
&&&&本报讯近日，中国农业科学院上海兽医研究所科研人员率先从发病鸭场分离鉴定出引起雏鸭高热、食欲不振、生长迟缓、产蛋下降乃至停止新发鸭传染病的病原，将之命名为“坦布苏病毒”，并成功研制出“鸭坦布苏病毒病活疫苗（FXP株）”。&&&&据科研人员介绍，该病毒与登革热病毒、西尼罗河病毒、乙型脑炎病毒均为黄病毒科黄病毒属的病毒。目前发现鸭坦布苏病毒不仅可以感染引起鸭、鹅等水禽发病，而且可以从鸡、麻雀等陆禽中分离到该病毒，表明这种新病毒宿主范围广泛，潜在危害巨大。自2010年春季以来，我国主要养鸭地区相继暴发由该病毒引发的疫情。研究人员还将分离到的鸭坦布苏病毒分离株（FX2010）在鸡胚成纤维细胞上连续传代、纯化，获得一株对鸭无致病性的毒株，该毒株不能经鼻腔感染易感鸭，也不能在鸭之间进行水平传播，但经肌肉接种却具有良好的免疫原性，低剂量即可激发出高滴度中和抗体。&&&&该疫苗临床试验申请获农业部批准，为该疫苗申请一类新兽药证书迈出关键的一步，同时也为有效防制鸭坦布苏病毒病带来曙光。&&&&&&&&&龙新
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