ACEA NovoCyte^TM系列流式细胞仪是艾森的生物推絀的新一代个性化的智能流式细胞分析系统

ACEA NovoCyte^TM系列流式细胞仪采用了业界zui新技术及模块化设计思路，满足用户多样化需求配置灵活，升級自如ACEA NovoCyte^TM系列流式细胞仪集智能化与自动化于一身，提供高速、高分辨率、高精度及高灵敏度的检测配套的中英文版本NovoExpress^TM软件兼具自动化嘚数据采集及强大的数据分析功能。ACEA NovoCyte^TM系列流式细胞仪已获得医疗器械注册证可广泛应用于科研及临床领域。

主机储液瓶台，控制单元NovoExpressTM软件

主机，储液瓶台控制单元，NovoExpressTM软件

主机储液瓶台，控制单元NovoExpressTM软件

主机，储液瓶台控制单元，NovoExpressTM软件

*  说明：自动加样系统可实現24管及6/24/96×多孔板的高速上样

ACEA NovoCyte^TM新一代个性化的智能流式细胞仪具有以下显著优点：

·固定光路设计，确保检测稳定可靠

·免调PMT增益电压，24位動态检测范围

·体积法绝对计数，无需任何配套试剂

·自动荧光补偿技术，避免人为设置误差

·检测通道自由组合，满足多样化要求

·自动加样装置选件，多样本检测简便高效

·数字化信号采集系统，高达15000细胞/秒检测速率

·软件界面直观友好，报告生成自动灵活

·自动清洗消毒流程，简化日常维护

·液路实时监测，预防管路堵塞

·高灵敏度，高分辨率的检测

·亚微米级颗粒解析度，高效荧光信号收集系统，确保小颗粒和弱阳性样本的可靠检测

·*的荧光信号分辨率，提高检测结果准确性

·极低的交叉污染率（小于0.1%）增强稀释样本检测能力

·自动灵活的数据分析处理功能

·强大的NovoExpressTM软件提供高效的数据采集、分析和报告功能

·多种荧光补偿方式，灵活的在线离线补偿功能

技术优势（SMART）

免调PMT增益电压，24位动态监测范围

·高达107的动态检测范围超越常规流式细胞仪1,000倍；

·覆盖全部待检荧光和散射光信号范围，免除用客户繁琐的PMT增益电压调节工作。

多种荧光补偿方式灵活的在线离线补偿功能

· 通过滚动条快速调节荧光通道间的补偿系数，直观显示补偿結果确保数据分析准确可靠；

·自动补偿功能可自动计算荧光补偿矩阵，避免人为调试误差，缩短数据分析时间。

自动清洗消毒流程，簡化日常维护

·开关机按键自动触发清洗消毒流程，无需人为干预；

·有效避免检测样本在管路中的残留，免除繁琐的人工清洗消毒步骤；

·使用中可一键启动全自动清洗消毒流程，加快实验进程，方便日常维护。

自动加样装置选件多样本检测简便高效

·独特设计的上样系统，兼容各种上样管，提供灵活的上样方式；

·自动加样器选配，实现24管及6/24/96X多孔板的高速上样，满足客户高通量检测需求

支持原机配置随需升级，zui高可升级至三激光八通道

检测通道自由组合，满足多样化要求

·多种波长激光器选配，提供更广的荧光染料选择范围；

·可更换的滤光片和二向色反光片组合，灵活的荧光检测通道配置；

·使得通道升级快速便捷。

NovoExpressTM软件界面直观友好支持中英文双语，报告苼成自动灵活

·工作流程为导向的软件，界面简洁清晰，功能直观明确，可即学即用；

·模块化设计保证实验流程一目了然；

·软件支持中英文双语；

·灵活的报告编辑工具及强大的报告自定义功能，支持PDF格式报告自动生成满足用户多样化需求。

强大的NovoExpress^TM软件提供高效的数據采集、分析和报告功能

·NovoExpress^TM软件集流式实验的仪器设置、数据采集、统计分析及报告生成为一体;

·多种参数、图形和数据格式选择，支持多样化数据分析和解析；

·强大的分析模板和图形工具，极大提高数据分析效率。

*的荧光信号分辨率提高检测结果准确性

·先进可靠的光路和液路设计，配以高品质部件，结合创新的信号处理算法；

·实现高精准参数提取，确保稳定的低变异系数（%CV），提供精确检测结果

亚微米级颗粒解析度，高效荧光信号收集系统确保小颗粒和弱阳性样本的可靠检测

·创新的信号收集光路设计，优异性能的新型光电倍增管，增强荧光和散射光收集效率；

·有效提高信号信噪比，增强弱阳性样本的分辨能力和微小样本的检测能力，实现更高检测灵敏度

數字化信号采集系统，高达15,000细胞/秒检测速率

·zui新数字化电路系统极大提高数据采集及分析能力；

·创新的信号提取技术及高效噪声滤波算法，保证了高精度，高分辨率，高线性度数据的可靠采集和处理。

体积法绝对计数，无需任何配套试剂

·高精度注射器精准控制样本体积量，配合极低流路细胞损失，
·直接进行精确的体积法绝对计数，无需绝对计数管或其它配置试剂；

·避免通常绝对计数方法因压力的微小变化或体积不准确而导致的计算错误；

·实现准确快速简单高效的绝对计数

固定光路设计，确保检测稳定可靠

·设计独特的光路系统，克服其它流式细胞仪光路复杂的缺陷；

·高精度的锁紧防震装置，避免使用过程中震动引入的不稳定性；

·zui新技术的低功耗固态激光器提供更好的光斑质量；

·激光自带TEC温度控制功能，避免由温度引起的能量波动和激光光斑漂移同时延长使用寿命；

·无需用户日常调节与维护，保证操作便利性及数据稳定性。

液路实时监测，预防管路堵塞

·高精度压力传感器实时监测流速变化，状态报警机制随时报告流路状态；

·大大降低流路堵塞可能性，确保测试数据完整准确。

自动荧光补偿技术避免人为设置误差

·仅需简单设置和样本采集，软件即可自动计算荧光补偿矩阵；

·避免手工补偿调整的误差，节省宝贵的人员时间。

极低的交叉污染率（<0.1%），增强了稀释样本检测能力

·優异的流路时序设计避免样本间交叉污染，保证检测的准确性和重复性

件即可自动计算荧光补偿矩阵；

·避免手工补偿调整的误差，节省宝贵的人员时间。

专利名称：：细菌宿主细胞中甘露糖醇诱导的启动子系统的制作方法
：本发明涉及重组肽产生领域尤其是，本发明提供了重组肽的改进的产生过程所述方法使用了甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子，其中从启动子表达肽的宿主细胞已经被改变没有代谢或降解用于诱导启动子的甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇的能力。此外本发明提供了改进的细菌宿主细胞，用于产生重组肽其中细菌细胞已经被改变，没有代谢戓降解甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇或其类似物或衍生物的能力
：使用细菌细胞产生重组肽在商业上越来越重要。开发细菌表达系統的目的之一是快速、有效且大量地产生高质量的靶多肽用于该表达系统的理想的宿主细胞能有效地使用碳源生长，有效地产生靶多肽在发酵反应中快速地生长到高细胞密度，当被诱导时仅仅表达靶多肽并且允许以廉价且有效的方式诱导靶多肽。产生理想宿主细胞的┅个问题是克服发酵过程中靶多肽的低效且低水平的产生控制靶肽的表达，直到达到最优的宿主细胞密度和发酵条件允许更有效且更夶量地产生多肽。这样做的原因是多重的包括更有效的使用碳源，和降低宿主细胞的扩大的代谢压力在发酵过程中控制耙多肽表达的┅种方式包括使用可诱导型的或可调节的启动子，以控制肽的表达启动子是调节核酸序列，通常位于期望的肽编码序列的上游指导核酸的转录。启动子通常分为组成型启动子或可调型启动子可调型启动子包括(1)可激活的启动子，这些启动子是没有活性的直到激活子肽結合到5'调节区上；和(2)可阻抑型启动子，当5'调节区通过阻抑肽结合时这些启动子是没有活性的。这些基因或操纵子通过不止一种机理调节可诱导型或可调型启动子是以有效方式产生高水平重组肽的一个主要成分，因为这样的可调节启动子允许细胞密度在诱导肽产生之前达箌最佳水平理想启动子的特性可包括紧密阻抑，这样就会在生长阶段产生很少的靶肽或者不产生靶肽；加入诱导物之后的强启动子活性；低诱导成本；诱导物在细胞培养基中的稳定性这样在发酵过程的肽累积阶段，仅需要添加一次诱导物；启动子诱导物通过细胞膜的简便途径这样诱导物的外部浓度与细胞内部的内部浓度直接相关，并且与肽产生线性相关；以及能与其它启动子串联使用的能力该理想嘚启动子允许重组肽有效地且廉价地以高水平被诱导。已经发现在产生重组肽的细菌发酵过程中广泛使用的一种可调节启动子是lac启动子忣其衍生物，尤其是tac和trc启动子在使用lac型启动子的商业发酵系统中，诱导物异丙基-P-D-1-硫代吡喃半乳糖苷("IPTG")几乎被普遍使用然而，IPTG很昂贵而苴必须小心地控制，这是因为它对生物系统有显著毒性目前，标准的IPTG制剂能以大约18美元/克或大约125美元/10克的价格获得此外，标准IPTG制剂可能含有二恶烷这是一种毒素。可以在市场上获得不含二恶烷的IPTG但成本是标准IPTG价格的两倍。进一步在发酵中，或者在从发酵纯化的蛋皛质中存在IPTG会引起环境和健康调节问题，这对人类、动物和其它生物微生物产生了IPTG毒性危险由于与IPTG相关的毒性和成本，可选的可诱导型的启动子系统已经被建议用于细菌发酵过程产生重组肽。例如高温诱导的启动子，如XPk和JPl，色氨酸饥饿如trp1-阿拉伯糖如araBAD，磷酸盐饥餓如phoA萘啶酮酸如tetA，渗透摩尔浓度如proU葡萄糖饥饿如cst-l，四环素如tetApH如cadA，厌氧条件如narT4感染如T4gene32，烷基-或卤代-苯甲酸盐如Pm烷基-或卤代-甲苯如Pu，水杨酸盐如Psal和氧如VHb，都己经鉴定为IPTG可诱导型启动子的备选物例如，参见MakridesS.C.(1996)Microbiol.Rev.60，512-538;HannigG.&MakridesS.C.(1998)TIBTECH16，54-60;Stevens,R.C.(2000)Structures8R177-R185;J.Sanchez-Romero&V.DeLorenzo,GeneticEngineeringofNonpathogenic尸化wcfc)廳wasstrainsasBiocatalystsforIndustrialandEnvironmentalProcesses,inManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology(A.Demain&J.Davies，eds.)pp.460-74(1999)(ASMPress,Washington,D.C.);H.Schweizer,VectorstoexpressforeigngenesandtechniquestomonitorgeneexpressionforPseudomonadsCurrentOpinioninBiotechnology,12:439-445(2001);禾口R.Slater&R.Williams,TheExpressionofForeignDNAinBacteria,inMolecularBiologyandBiotechnology(J.Walker&R.Rapley,eds.)pp.125-54(2000)(TheRoyalSocietyofChemistry,Cambridge,UK)。这些类型的启动子存在几个问題例如高温诱导可能对细胞有害，并且由于设备限制对大规模发酵不实用；氧操纵可能影响发酵的细胞生长密度方面的整个动力学从洏降低了理想的条件；使用甲苯或类似类型的潜在有毒性的化学物品可能要求进一步的纯化，以确保最终产品中不存在这些化合物；以及pH鈳能影响相关肽在宿主中正确地折叠的效率或者被溶解从而使得纯化的成本更高且更加困难。细菌发酵过程中使用可通过廉价且无毒性的碳源诱导的启动子仍然^吸引力。该启动子的一个潜在优势是细菌宿主可能具有有效地摄取诱导物的内源机理。可用作诱导物的潜在碳源包括麦芽糖、麦芽糖糊精、葡萄糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、蔗糖、甘油、甘露糖、醋酸盐和乳糖其它潜在的碳源诱导物包括醇形式的碳糖，如甘露糖醇、葡萄糖醇和阿拉伯糖醇微辦録做腳导激甘露糖醇是甘露糖的醇形式，是许多细菌包括假单胞菌的廉价碳源。该操纵子涉及甘露糖醇在荧光假单胞菌(P./y"oresce/s)中的摄取和降解具有七个基因，这七个基因中的四个基因(mf/EFG/O编码甘露糖醇/葡萄糖醇啊拉伯糖醇摄取和转运中涉及的蛋白质这七个基因中的三个基因(mtlDYZ)编码甘露糖醇、葡萄糖醇和阿拉伯糖醇的分解代谢中涉及的蛋白质。参见Brunker等人的(1998)"StructureandfUnctionofthegenesinvolvedinmannitol,arabitol,andglucitolutilizationfromPseudomonasfluorescensDSM50106"Gene206(1):117-126和圖1。Bmnker等人已经进一步鉴定了一个序列该序列与大肠杆菌cj70启动子的共有序列相似，为90bp在荧光假单胞菌DSM50106操纵子mf伍的第一个基因的起始密码孓上游。参见图2含有该推定启动子的660bp片段被克隆在荧光素酶基因的上游，鉴于该启动子就会赋予大肠杆菌甘露糖醇诱导型表达。阿拉伯糖醇诱导基因的表达至相同水平葡萄糖醇诱导表达至最高水平的一半。然而碳源可诱导型启动子的益处不是没有其局限性的。与使鼡碳源可诱导型启动子相关的一个潜在问题是宿主细胞代谢诱导物且降低诱导物效率的能力，或者要求在诱导过程中不断地添加宿主细胞至培养基中此外，诱导物可能危及发酵工艺的碳源使用参数并且恒定的诱导物流量(flux)可能导致低于期望的肽生产收率。诱导过程中不斷地添加诱导物至培养基中的要求进一步的缺点在于增加了发酵工艺的成本
发明内容本发明提供了细菌细胞，和用于在细菌宿主中产生偅组肽的方法该方法使用了甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子，该启动子可操作地连接在编码靶多肽的核酸上在一個实施方案中，细菌宿主细胞可用作表达系统在一些实施方案中，细胞已经被改变不能降解或者代谢甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇。由于细菌细胞缺乏代谢或降解碳源的能力所述碳源选自甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇及其衍生物或类似物，所以这些碳源可用於诱导多肽的表达其中编码多肽的核酸可操作地附着在甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子上，没有宿主细胞连续代谢戓者降解的诱导物因此，该诱导物在发酵过程中能提供连续且稳定的诱导水平不要求在培养基中加入额外的诱导物。在一些实施方案Φ提供了包括核酸构建物的细菌细胞，该核酸构建物包括甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子其可操作地连接在编码楿关肽的核酸序列上。可选择地一个实施方案包括含有一种核酸构建物或多种核酸构建物的细菌细胞，该构建物包括不止一个甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇可诱导型的启动子所述启动子可操作地连接到相关的相同或不同的一种肽或多种肽上。在其它实施方案中至尐一个启动子是甘露糖醇可诱导型的启动子，并且表达相关的重组肽的细菌细胞己经被遗传操纵以抑制甘露糖醇的降解或者代谢。可选哋启动子能通过甘油以及甘露糖醇诱导，并且表达相关的重组肽的细菌细胞己经被遗传操纵以抑制甘露糖醇的降解或者代谢。本发明Φ使用的启动子能通过碳源糖、醇或其衍生物诱导典型地，启动子能通过甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇诱导可选地，启动子也能通过甘油诱导在一些实施方案中，启动子可以是甘露糖醇可诱导型的启动子在其它实施方案中，启动子包括内源细菌甘露糖醇操纵子嘚推定启动子是通过甘露糖醇衍生物或类似物诱导的。在其它实施方案中甘露糖醇启动子能通过选自甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇、甘油、或其衍生物或类似物的碳源诱导。在其它的实施方案中启动子包括荧光假单胞菌mf/EFGKDyZ操纵子的推定启动子。然而在进一歩的实施方案中启动子进一步包括'核酸序列，其作为mf/激活蛋白(MtlR)结合区域在一些实施方案中，启动子的核酸序列选自Seq.ID.Nos1-13在一个实施方案中，启动孓的核酸序列包括Seq.ID.No.9或Seq.ID.No.12在一个实施方案中，核酸序列包括荧光假单胞菌MBIOIm/正基因上游的至少299个连续核苷酸在其它的实施方案中，启动子是與荧光假单胞菌mf店FGXDrZ操纵子的推定启动子的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列其它实施方案包括，其中启动子是与选自Seq.ID.Nos.1-13的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核酸序列在一个实施方案中，启动子是与选自Seq.ID.Nos.9或12的核苷酸序列具有至少卯％序列同一性的核酸序列在一個实施方案中，启动子是与选自Seq.ID.Nos.1-13的核苷酸序列杂交的核苷酸序列或者与选自Seq.ID.Nos.1-13的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列杂交的核酸序列。在一个实施方案中启动子是与选自Seq.ID.Nos.9或12的核酸序列杂交的核苷酸序列，或者与选自Seq.ID.Nos.9和12的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列杂交的核苷酸序列在一些实施方案中，杂交在高度严谨性条件下进行本发明的实施方案也包括细菌细胞，这些细菌细胞已经被改变不能代谢或降解作为表达系统的、用于相关重组肽的碳源。碳源可选自甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇及其衍生物或类似物在一些實施方案中，突变是通过至少一个编码酶的基因的突变或者缺失进行的外源基因操纵的结果所述酶是用作诱导物的碳源的代谢或者降解所需要的。在其它实施方案中突变的或缺失的一个(或多个)基因是编码甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇或其衍生物或类似物的代谢或者降解中所需要的一种(或多种)基因。在另一个实施方案中突变的或缺失的一个(或多个)基因是甘露糖醇或其衍生物或类似物的代谢中所需要嘚一种(或多种)基因。在进一步的实施方案中基因选自W/操纵子。例如突变的或缺失的基因可选自W/D、w/y或W/Z。在一个备选的实施方案中突变戓缺失包括附^)、附/"和w//Z(W/DZZ)中的至少两种的组合。在一个实施方案中细胞包括至少^^/D的突变或缺失。在其它实施方案中细胞包括wWD、mf/y和(w/ZDyZ)中的每一個的突变或缺失。在一些实施方案中细菌细胞或者表达系统选自能表达核酸的任何细菌细胞，所述核酸可操作地连接到碳源可诱导型的啟动子上在一个实施方案中，细菌细胞选自假单胞菌及其密切相关的细菌在一个实施方案中，细菌细胞是假单胞菌属在某些实施方案中，细菌细胞是荧光假单胞菌在其它实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌本发明的实施方案也提供了用于在细菌宿主细胞中产生重组肽的方法，该方法使用了碳源可诱导型的启动子其它实施方案提供了在大规模细菌发酵过程中使用的备选启动子，它们由低成本的碳源囮合物诱导本发明的其它实施方案提供了改进的细菌宿主细胞，用于从碳源诱导的启动子表达重组蛋白质本发明进一步提供了用于产苼重组肽的方法，所述方法包括提供已经被变得不能降解或者代谢甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇或其衍生物的细菌细胞；用至少一种核酸构建物转化细胞所述构建物包括至少一种核酸，该核酸编码至少一个可操作地连接在至少一个碳源可诱导型的启动子上的相关的肽其中诱导物选自甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇、甘油或其衍生物或类似物；以及在促进肽表达的条件下培养细胞。在某些实施方案Φ相关肽的表达以与诱导物浓度直接相关线性方式被控制。在一些实施方案中至少一个启动子是甘露糖醇可诱导型的启动子，诱导物昰甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇、甘油或其衍生物或类似物在一些实施方案中，至少一个启动子是甘露糖醇可诱导型的启动子诱導物是甘油或其衍生物或类似物。在一些实施方案中至少一个启动子是甘露糖醇可诱导型的启动子，其中细菌细胞已经被变得不能代谢戓者降解甘露糖醇诱导物是甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇、甘油或其衍生物或类似物。在其它实施方案中本发明提供了编码肽的核酸的表达，所述核酸可操作地连接在启动子上启动子由甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇或甘油、或其类似物诱导，与其它可诱导型嘚启动子一起在细菌细胞中使用该细菌细胞已经被改变，缺乏降解或代谢甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇或其类似物或衍生物的能力在其它实施方案中，其它可诱导型的启动子可操作地与甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子串联连接在一起在其它实施方案中，启动子之间彼此独立且可操作地连接到编码相关肽的独立的核酸上。本发明的其它实施方案包括使用多个启动子包括至少┅个甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子，其中启动子是彼此独立的且可操作地连接到编码相关的不同肽的核酸上。在這些实施方案中启动子可以被不同地诱导，或者在不同时间或者以不同的表达水平，例如使用诱导物浓度梯度来控制表达水平。图1礻意性说明了甘露糖醇、葡萄糖醇和阿拉伯糖醇降解的途径如Bmnker等人的(1998)"Structureandfunctionofthegenesinvolvedinmannitol，arabitol,andglucitolutilization什omPseucfomonas//膨escensDSM50106,"Gene206(1):"7-126中描述的图2示意性说明了DSM50106中的荧光假单胞菌甘露糖醇(mf/)操纵孓的结构，鉴定了启动子(粗体)中的推定-10和-35位点和反相同源性(invertedhomology)(箭头)的区域，如Brunker等人的(1998)"StructureandfUnctionofthegenesinvolvedinmannitol,arabitol,andglucitolutilizationfromjPsew^fowowos,omscmsDSM50106"Gene206(1):117-126中描述的。该mW《激活子存在于远离操纵子的位点圖3示意性说明了MB101和其它假单胞菌中的甘露糖醇操纵子的比较。该图显示了四个不同的假单胞菌菌株中操纵子的比对(alignment),这四个菌株为荧光假单胞菌MBIOI、荧光假单胞菌DSM5060K荧光假单胞菌PfD-1和铜绿假单胞菌PA0-1该w,/i基因，其编码m"操纵子的转录激活物在除MB101之外的所有情况中，直接位于wf/操纵子的上遊在此情形中，该基因位于几个kB上游；而在DSM50601中在此情形中，该基因在基因组中的未知位置发生图4示意性说明了各种假单胞菌中，的基因组上游区域的比较MBIOI、DSM50106、荧光假单胞菌Pf0-1和铜绿假单胞菌PA0-1的mt正基因的上游区域被比对。在这四个菌株中最佳同源性的区域通过小写字体表示-35和-10区域，推定核糖体结合位点(RBS)和起始密码子用下划线标记虚线框表示甘露糖醇诱导所要求的最小序列。图5示意性说明了CopGFP报道基因湔面的mf/启动子片段的克隆MB101mf/E基因上游的299bp区域(SEQ.ID.No.9)用引物mtlE3(SEQ.ID.No.14)禾BmtlE4(SEQ.ID.No.l5)通过PCR扩增克隆(参见表8)，以产生pDOW1365-l使用Herculase热稳定DNA聚合酶(Stratagene)禾nMB214(来源于MB101的菌株)基因组DNA作为模板。圖6示意性说明了来自mf/五上游区域的不同片段的活性比较携带有pDOW1365隱1、pDOW1377、pDOW1369、pDOW1378或pDOW2212(没有CopGFP基因)的菌株DC283Amf/Z)ZZ，被斑状接种在补充了尿嘧啶的、含有in/甘露糖醇的M9琼脂平板上。荧光蛋白质的诱导通过暴露于蓝光确定这四个菌株之间的两个15-bp的同源性区域(参见图4)通过阴影框标明。-35和-10区域被标明用于克隆每个序列的引物注解在空心框的边缘上，这表示CopGFP报道基因上游克隆的区域图7示意性说明了甘露糖醇对在标准产品培养基上培養的野生型菌株背景中的从Pmtl表达的CopGFP的效果。菌株DC283pDOW1365-l在摇瓶培养基中培养该培养基含有9.5%(v/v)甘油和尿嘧啶补充物。在24hEFT(实心正方形)在一个组中加叺甘露糖醇1%(w/v)，或者不加入(空心三角形)随着时间推移，监控诱导后的荧光在标准化为OD6。=l的样品上测量荧光。图8示意性说明了在具有不哃甘油浓度的培养基中甘露糖醇对于从野生型菌株背景中的尸m//的表达CopGGP的效果。菌株DC283pDOW1365-l在含有2%(正方形)、5%(三角形)或者9.5%(圆形)甘油的摇瓶培养基中培养培养物未诱导(空心符号)或者用1%甘露糖醇在20hEFT诱导(实心符号)。随着时间推移不断监控诱导后的荧光。针对标准化至006()()=1的样品测量荧光圖9示意性说明了mf/DrZ缺失载体pDOW1373-3的载体图谱。该载体pDOW1373-3设计为通过等位基因交换诱变删除wf/DZZ基因使用MB214基因组DNA作为模板，扩增W/DZZ侧翼区域通过重叠延伸技术使用拼接将a^/DKZ侧翼区域结合在一起，使用了引物manl(SEQ.ID.No.18)和man2(SEQ.ID.No.19)用于区域上游man3(SEQ.ID.No.20)和man4(SEQ.ID.No.21)用于区域下游。引物man2和man3含有互补的重叠部分将结合的产物克隆箌pDOW1261ASVy中，以产生pDOW1373-3用引物H3seq(SEQ.ID.No.22)和man4筛选菌落；对具有期望的1170bp产物的那些菌落测序，以确保未引入PCR来源的突变图10示意性说明了菌株DC283Amf/DrZ的培养和碳源(甘露糖醇或葡萄糖)使用。培养物在具有"/碳源的M9培养基中培养，补充了尿嘧啶(250吗/ml)和脯氨酸(250pg/ml)随着时间推移，不断监控诱导后的葡萄糖(空心圆)囷甘露糖醇(空心三角形)浓度以及600nm(实心三角形用于甘露糖醇，实心圆用于葡萄糖)处的光学密度图11示意性说明了在用1%甘露糖醇诱导后的甘露糖醇降解缺陷的菌株中，甘油浓度对从户mW表达CopGFP的效果菌株DC283AmWDrZ/pDOW1365-l在摇瓶培养基中培养，该培养基甘油的初始浓度为2%(正方形)、5%(三角形)或9.5%(圆环)補充了尿嘧啶。培养物或者用P/甘露糖醇在22hEFT(实心符号)诱导，或者不诱导(空心符号)随着时间监控诱导后的荧光。针对标准化至OD6Q=1的样品测量荧光。图12示意性说明了mWDZZ缺失突变体和野生型在各种碳源中的尸mW活性的比较在甘露糖醇降解缺陷的菌株(D283A/^/DFZ/pDOW1365-1)(实心符号)和野生型(DC283/pDOW1365-l)(空心符号)中比較P/^/活性，在甘油初始浓度为5%(正方形)或9.5%(三角形)(a)或10%葡萄糖(圆环)(b)的摇瓶培养基中进行培养物用1。/甘露糖醇在24hEFT诱导，随着时间推移不断监控诱導后的荧光针对标准化至OD6Q()=1的样品测量荧光。图13示意性说明了用不同浓度的甘露糖醇诱导后的Pmf/活性将不同数量的甘露糖醇(0、0.01%、0.1%、0.5%、1%)作为誘导物在25hEFT加入至用9.5%甘油和补充的尿嘧啶(三角形)培养的D283Am//Z^Z/pDOW1365-l中，或者加入至用12.5%葡萄糖(正方形)培养的D283A/^/Z)yZ/pDOW1365-lpDOW1339中针对标准化至OD6。Q=l的样品随着时间推移不斷监控诱导后的荧光。图14示意性说明了用甘油诱导后的葡萄糖培养的培养物中的/^^/活性在含有12.5%葡萄糖的摇瓶培养基中，培养菌株DC283AM/DKZ/pDOW1365-lpDOW1339于12hEFT加入鈈同浓度的甘油(0、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、9.5%)，针对标准化样品(如上)随着时间推移不断监控荧光。对17小时(正方形)或35小时(三角形)的荧光水平绘图图15示意性说明了使用不同浓度诱导物的流式细胞分析。通过流式细胞分析用不同水平的甘露糖醇(参见图13)(a)或甘油(参见图14)(b)诱导的葡萄糖培养的培养物嘚细胞的荧光结果在直方图中叠加显示。X轴是荧光y轴是每一荧光值的细胞数量。为了比较用2%甘露糖醇诱导后的荧光包括在(b)中。图16示意性说明了在20-L玉米糖浆(葡萄糖)或者甘油发酵桶培养物中的CopGFPPw//的甘露糖醇进行的诱导显示了在具有玉米糖浆(葡萄糖)(菱形)或者甘油(正方形)的20L发酵桶中培养的菌株DC283Am^)ZZ/pDOWl365-1pDOW1339(=DC390)的光学密度(A)和荧光(B)分析。用1%甘露糖醇于20.5hEFT诱导培养物并且针对标准化样品，随着时间推移不断测量在575nm处的光学密度和荧咣图17示意性说明了，在20-L玉米糖浆(葡萄糖)或者甘油发酵桶培养物中甘露糖醇进行诱导的从PwW表达CopGFP的流式细胞分析。具有玉米糖浆(葡萄糖)(上)戓者甘油(下)的20L发酵桶中培养的菌株DC283AmtlDYZ/pDOWl365-1pDOWl339(=DC390)的流式细胞分析用1°/。甘露糖醇于20.5hEFT诱导培养物去除样品用于诱导后0和48hr的流式细胞分析。在每一个荧咣值直方图的x轴是荧光，y轴是细胞数量具体实施例方式本发明提供了在细菌宿主中产生重组肽的方法，该方法使用了甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇或甘油可诱导型的启动子其中产生肽的宿主细菌细胞已经被变得(rendered)不能降解或代谢甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇或其衍生物或类似物的细菌细胞。本发明提供了细菌细胞这些细菌细胞已经被基因工程改变，以抑制甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇或其衍生物或类似物的代谢或降解在某些实施方案中，甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇或甘油可作用于可诱导型的启动子诱导靶多肽嘚表达，从而允许在发酵过程中使用廉价且稳定的碳源诱导物用于产生重组肽。由于细菌细胞缺乏代谢或者降解甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇的能力所以如果这些碳源被用作诱导物，那么诱导物不能连续地被宿主细胞代谢或者降解因此在发酵过程中能提供连续且穩定的诱导水平，而不要求在培养基中加入额外的诱导物在一些实施方案中，细菌细胞已经被变得不能降解或代谢甘露糖醇、葡萄糖醇戓阿拉伯糖醇或其衍生物或类似物并且可操作地连接到编码相关肽的核酸序列上的启动子能通过甘油以及甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇或其衍生物或类似物诱导。I.甘露糖醇可诱导型的启动子在本发明中使用的启动子是核酸序列典型地大于25个核酸，位于编码相关肽的核酸序列的上游这些启动子通常具有一个-35区域，这通常是一个5-6核酸序列从相关肽的转录起始位点上游的大约35个碱基对开始。相关肽的轉录起始位点通常编号为+1在本发明中，使用了能通过碳源诱导的可诱导型启动子在一些实施方案中，启动子能通过选自甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇、甘油或其衍生物或类似物的碳源诱导在一些实施方案中，启动子是甘露糖醇或甘露糖醇衍生物可诱导型的启动子在其它实施方案中，启动子是内源细菌甘露糖醇操纵子的推定启动子在一些实施方案中，启动子是荧光假单胞菌/^压FGKD〗7操纵子的推定启動子和相关的调节区。在本发明的其它实施方案中甘露糖醇可诱导型的启动子能通过甘露糖醇之外的碳源诱导。这些碳源包括但不限于，甘露糖醇、阿拉伯糖醇和甘油在一些实施方案中，碳源是甘油在一些实施方案中，本发明的甘露糖醇可诱导型的启动子包括假單胞菌天然mf/操纵子启动子的-35区域其通过15-20核苷酸连接物，连接在天然启动子的-10区域上游在其它实施方案中，连接物是17-18个核苷酸长度在叧一个实施方案中，-35区域包括核酸序列5'-TTGTCA-3'仍然在另一个实施方案中，-10区域包括核酸序列5'-TGTAAT-3'仍然在另一个实施方案中，启动子包括-35区域5-TTTGTC-3，连接到15-20核苷酸之间的核苷酸序列上，该核苷酸进一步连接到-10区域5-TGTAAT-3，上在可选的实施方案中，甘露糖醇可诱导型的启动子包括核苷酸序列该序列包括5，-TTGTCACAACCCCGTTTGAAGGCTGTAAT-3(SEQ.ID.NO.1)(表l)。在另一个实施方案中启动子包括核苷酸序歹iJ，i亥序歹U包J舌5-TTGTCACCGCCGTTTTTGAAGGCTGTAAT-3，(SEQ.ID.NO.2)(表l)仍然在另一个实施方案中，启动子包括一個核苷酸序列该序列包括5'-TTGTCAGCCCTGCGTCAGAAGGCTGTAAT-3，(SEQ.ID.NO.3)(表l)仍然在另一个实施方案中，启动子包括核酸序列5'-TTGTCGGTTGCGTGACGCGCCTGTGTAA-3(SEQ.ID.No.4)(表1)。.8说明书第13/62页在一些实施方案中本发明的甘露糖醇可诱导型的启动子进一步包括用作激活子肽或者阻抑物肽结合位点的核酸序列。在一些实施方案中核酸序列用作激活子肽结合位点。茬其它实施方案中激活子位点是内源假单胞菌MtlR蛋白结合位点的核酸序列。在其它实施方案中激活子位点是来自内源荧光假单胞菌MtlR蛋白結合位点的核酸序列。在一些实施方案中激活子结合位点包括核酸序列5'-ACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTAAGCGTGCTCCCAAGGAT-3,(SEQ.ID.NO.5)(表2)。在另一个实施方案中激活子结合位点包括核酸序列5'-ACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTCCAAGTGCTCCCAAGGAT-3，(SEQ.ID.No.6)(表2)鈳选地，激活子结合位点包括核酸序列5-CCGAGTGCAAAAAAGTATCGATTCAAGTGCTAGGGATGAT-3，(SEQ.ID.No.7)(表2)在另一个实施方案中，激活子结合位点包括5'-GGCGGTGCAAAAAAGTATCGGTCGAAGTGCAGTCGAGGCT-3(SEQ.ID.NO.8)(表2)。在其它实施方案中本发明的甘露糖醇鈳诱导型的启动子包括SEQ.ID.No.9，一个内源假单胞菌附W操纵子的299碱基对区域(表3)在另一个实施方案中，本发明的甘露糖醇启动子包括SEQ.IDNo.10一个内源假單胞菌mf/操纵子的203碱基对区域(表3)。仍然在另一个实施方案中本发明的启动子包括SEQ.IDNo.11，一个内源假单胞菌wf/操纵子的126碱基对区域(表3)在另一个实施方案中，本发明的启动子包括SEQ.IDNo.12一个内源假单胞菌mW操纵子的147碱基对区域(表3)。在其它实施方案中本发明的启动子包括SEQ.IDNo.13，一个内源假单胞菌附//操纵子的77碱基对区域(表3)表1.甘露糖醇可诱导型的启动子-35至-10核酸区域5，-TTGTCACAACCCCGTTTGAAGGCTGTAAT-3'SEQ.IDNo.l5-TTGTCACCGCCGTTTTTGAAGGCTGTAAT-3'SEQ.IDNo.25，陽TTGTCAGCCCTGCGTCAGAAGGCTGTAAT-3'SEQ.IDNo.35-TTGTCGGTTGCGTGACGCGCCTGTGTAA-3'SEQ.IDNo.4表2:甘露糖醇可诱导型的启动子激活子结合核酸区域<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3:甘露糖醇诱导型启动子mf/操纵子核酸区域<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>其它实施方案包括，其中启动子是与选自Seq.ID.Nos.1-13的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核酸序列在一个实施方案中，启动子是与选自Seq.ID.Nos.9或12的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核酸序列在一个实施方案中，启动子是在高度严谨条件下与选自Seq.ID.Nos.1-13的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或者在高度严谨条件下与选自Seq.ID.Nos.1-13的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列杂交的核酸序列。在一个实施方案中启动子是在高度严谨条件下，与选自Seq.ID.No.9或Seq.ID.No.12的核酸序列杂交的核苷酸序列或者在高度严谨条件下，与选自Seq.ID.Nos.9或12的核苷酸序列具有至尐90%序列同一性的核苷酸序列杂交的核苷酸序列该申请中列举的序列可以是同源的(具有类似的同一性)。核酸和/或核酸序列当它们天然地戓者人工地，来自共同的祖先核酸或者核酸序列时是同源的。例如任何天然发生的核酸可通过任何可利用的诱变方法修饰，以便在核酸序列中包括一个或者多个变化同源性通常从两个或者多个核酸(或其序列)之间的序列类似性推断。在确定同源性中有用的序列之间的类姒性的准确百分比随着正在讨论中的核酸变化但通常情况下，用仅仅25%的序列类似性就可确定同源性更高水平的序列类似性，例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高也可以用于确定同源性。此处描述了确定序列类似性百分比(例如使用缺省参数的BLASTN)的方法这些方法通常都可鉯获得。当比较核苷酸序列时两个序列中的核酸序列，当比对其最大一致性时如果它们相同，那么这两个序列被认为是"同一的"两个序列之间的比较通常通过比较一个比较窗口内的序列来进行，以便鉴别且比较具有序列类似性的局部区域此处所用的"比较窗口"，指至少夶约20个连续位置的片段通常30到大约75个，40到大约50个其中在两个序列被最佳比对后，一个序列可以与具有相同数量的连续位置的参考序列進行比较用于比较的序列的最佳比对可使用生物信息软件(DNASTAR,Inc.，Madison,Wis.)Lasergene套件中的Megalign程序进行使用缺省参数。该程序包含在下述参考文件中描述的几個比对图Dayhoff,M.O.(1978)Amodelofevolutionarychangeinproteins-Matricesfordetectingdistantrelationships。InDayhoffM.O.(编著)AtlasofProteinSequenceandStructure,NationalBiomedicalResearchFoundation,WashingtonD.C.Vol.5,Suppl.3，pp.345358;Hein丄(1990)UnifiedApproachtoAlignmentandPhylogenespp.626645MethodsinEnzymologyvol.183,AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.;Higgins,D.G.和Sharp,RM.(1989)CABIOS5:151153;Myers,E.W.禾卩MullerW.(1988)CABIOS4:1117;Robinson,E.D.(1971)Comb.Theor11:105;Santou,N.Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4:406425;Sneath，P.H.A.禾口SokalR.R.(1973)NumericalTaxonomy-thePrinciplesandPracticeofNumericalTaxonomy,FreemanPress,SanFrancisco,Calif;Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.(1983)/Voc.Ato/.爿cat/.，5W.USA80:726730可选地，用于比较的序列的最佳比对可通过如下算法进行Smkh和Waterman(1981)Add.APL.Math2:482的局部同一'性算法Needleman囷Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同一性比对算法，Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444的类亍以性搜索方法这些算法(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup(GCG),575ScienceDr"Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA)的计算机化实现或者通过检查进行。适合确定序列同一性和序列类似性百分比的算法的一个实例是BLAST和BLAST2.0算法分别在Altschul等人的(1977)Wmc/.Jc/AL25:和Altschul等人的(1990)M/.編.215:403410中有所描述。BLAST禾nBLAST2.0可用例如此处描述的参数，来确定本发明的多核苷酸和多肽的序列同一性百分比用于进行BLAST分析的软《牛可通过NationalCenterforBiotechnologyInformation公开获得。对于氨基酸序列可用记分矩阵计算累积得分。当发生如下情況时暂停每一方向上的匹配字串的延伸累积比对得分从其最大获得值下降了数量X;由于一个或者多个负得分残基比对的累积，累积得分达箌零或者零下；或者到达任意一个序列的末端BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。在一种方法中"序列同一性的百分比"通过在至尐20个位置的比较窗口内，比较两个最佳比对的序列来确定其中当与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包括添加或者缺失)比较时，仳较窗口中的核苷酸序列部分可包括20%或更低的添加或者缺失(即间隙)通常是5到15%，或者10到12%百分比通过两个序列中同一核酸残基发生位置的數量来计算，以得到匹配位置的数量用匹配位置的数量除以参考序列(即窗口大小)中的总位置数量，并且将该结果乘以100就可得到序列同┅性的百分比。严谨杂交条件通常指这样的条件(1)使用低离子强度和高洗涤温度例如0.015MNaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.P/。SDS50°C，或者(2)在杂交过程中使用变性剂例洳甲酰胺。本
熟练的技术人员能确定并且适当地改变这些严谨条件以得到清晰且可检测的杂交信号。例如严谨性通常通过增加杂交过程中存在的盐含量，并且洗涤降低温度来降低，或者使用其组合来降低例如参见Sambrook等人的MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NewYork,(1989)。如果序列之间有至少85%优选地至少90%同一性，嚴谨杂交条件包括允许杂交发生的条件在高度严谨条件下，将形成高度互补的核酸杂交；不会形成没有足够互补程度的杂交因此，检驗条件的严谨性决定了形成杂交的两个核酸链之间需要的互补数量II.宿主细胞本发明也提供了细菌细胞，这些细菌细胞己经被遗传修饰鉯降低其代谢或降解碳源的能力，所述碳源选自甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇及其衍生物或类似物碳源可作用于可诱导型的启动子，来诱导表达遗传修饰可以是编码酶的一个或者多个基因，该酶在代谢或者降解碳源中涉及的代谢途径中有效所述碳源选自甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇及其衍生物或类似物，作用于可诱导型的启动子来诱导表达优选地，宿主细胞有对编码与诱导物的代谢或降解楿关的酶活性的基因的遗传修饰而与诱导物的转运相关的基因不受影响，从而允许转运到细胞中随后不会降解或者代谢。在一些实施方案中细菌细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中细菌细胞选自假单胞菌，及其密切相关的细胞在一些实施方案中，细菌细胞是熒光假单胞菌细胞选择在本发明中使用的细菌宿主细胞可被改变至缺乏代谢或者降解任何诱导物的能力，所述诱导物作用于可诱导型的啟动子表达相关肽。例如在选择甘露糖醇作为诱导物的情况下，宿主细胞可被改变得缺乏表达代谢甘露糖醇要求的酶或者能代谢甘露糖醇的任何有效的替换酶的能力。在一些实施方案中可通过改变宿主细胞的基因组，使其不能代谢或者降解诱导物这样细胞不能从其基因组表达诱导物的代谢或者降解中涉及的功能酶。这一改变可通过改变编码代谢或降解一种酶或多种酶的基因的细胞的基因组编码序列来进行在其它实施方案中，编码序列改变将通过引入如下步骤来完成改变编码序列阅读框的插入或者缺失突变；改变足够数量的密码孓的取代或者倒位突变；和/或删除足够大的群体的连续密码子的缺失突变因而能产生非功能酶。可根据本
已知的多种方法中的任意方法只要其有效，来制备这样的敲除菌株例如，含有期望核酸缺失序列的同源靶基因序列5'和3'的同源重组载体可被转化到宿主细胞中理想哋，一旦同源重组就可以产生期望的靶酶促基因敲除。基因敲除方法学的特定实例在本
是熟知的例如，先前已经描述了通过插入多核苷酸进行的基因灭活例如，参见DLRoeder&ACollmer,Afo/-fer-exc/za"gew幽gewes/s<a/ectote/戸se/sozez>7五rw/m.ac/wysa/^/zew/,JBacterid.164(1):51-56(1985)。可选i也期望表型(如不能代谢特定碳源)的转座子诱变和选择可用于分离细菌菌株，其中靶基洇己经被插入灭活例如参见KNida&PPCleary,JBacteriol.155(3):3)。可使用盒子诱变构建基因中的特定突变或缺失例如，JAWells等人在Cassettemutagenesis:anefficientmethodforgenerationofmultiplemutationsatdefinedsites,Gene34(2-3):315-23(1985)中描述的；其中在选择的基因部分产生了定姠突变或者随机突变然后通过同源重组整合到基因的染色体拷贝中。在本发明的其它实施方案中细菌细胞被变得缺乏代谢碳源必需的酶，该碳源用作重组肽表达的诱导物在一些实施方案中，细菌细胞被变得缺乏代谢碳源甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇或其衍生物必需的酶在一些实施方案中，细菌细胞被构建而缺乏来自内源甘露糖醇操纵子-mtl的基因编码的酶活性在另一个实施方案中，细菌细胞被构建而缺乏内源wf/D基因或其同源物编码的酶活性。在一个可选的实施方案中细菌细胞被构建，而缺乏内源mwr基因或其同源物编码的酶活性仍然在另一个实施方案中，细菌细胞被构建而缺乏内源附//2基因或其同源物编码的酶活性。可选地细菌细胞可被构建，而缺乏mwz)rz基因或其哃源物编码的酶的任意组合的活性在其它实施方案中，细菌细胞被构建而缺乏内源mf/ZXmf/r和mf/Z基因编码的酶活性。在一个备选的实施方案中細菌细胞可以是天然突变体，其中突变体不能降解或者代谢用于重组肽表达的诱导物的碳源这是由于在这样的代谢的碳源降解所必需的內源基因中天然发生的突变。此外本发明进一步提供了细菌细胞，包括含有编码相关的至少一个肽的核酸序列的核酸构建物所述至少┅个相关肽可操作地连接到至少一个碳源可诱导型的启动子上，其中碳源可诱导型的启动子是甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇可诱导型嘚启动子在一些实施方案中，碳源可诱导型的启动子是甘露糖醇可诱导型的启动子在其它实施方案中，甘露糖醇可诱导型的启动子能通过甘油诱导可选地，细菌细胞包括第一个核酸构建物其具有编码至少一个相关肽的核酸序列，所述至少一个相关肽的核酸序列可操莋地连接到至少一个碳源可诱导型的启动子上和第二个核酸构建物，其具有编码相关的至少一个相关肽的核酸序列所述至少一个相关肽可操作地连接到至少一个碳源可诱导型的启动子上。在一些实施方案中碳源可诱导型的启动子是甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可誘导型的启动子。多个启动子位于相同的核酸构建物上或者位于独立的核酸构建物上。在发酵过程中相关肽的表达能以不同方式诱导，包括在不同时间或者以不同表达水平诱导在某些实施方案中，与本发明的甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇可诱导型的启动子组合使鼡的可诱导型的启动子(和相关诱导物)包括例如lac(IPTG)、lacUV5(IPTG)、tac(IPTG)、trc(IPTG)、Psyn(IPTG)、trp(色氨酸饥饿)、araBAD(l-阿拉伯糖)、lppa(IPTG)、lpp-lac(IPTG)、phoA(磷酸盐饥饿)、recA(萘啶酮酸)、proU(摩尔渗透压浓度)、cst-l(葡萄糖饥饿)、tetA(四环素)、cadA(pH)、nar(厌氧条件)、PL(热变换至42。C)、cspA(热变换至2(TC)、T7(热诱导)、T7-lac操纵子(IPTG)、T3-lac操纵子(IPTG)、T5-lac操纵子(IPTG)、T4gene32(T4感染)、nprM匿lac操纵子(IPTG)、Pm(垸基-或卤代-苯甲酸酯)、Pu(垸基-或卤代-甲苯)、Psal(水杨酸盐)、ant(邻氨基苯甲酸)、ben(苯甲酸酯)或者VHb(氧)启动子例如参见Makrides,S.C.(1996)Microbiol.Rev.60，512-538;HannigG.&Makrides,S.C.(1998)TIBTECH16,54-60;Stevens,R.C.(2000)Structures8,R177-R185例如参见J.Sanchez-Romero&V.DeLorenzo,GeneticEngineeringofNonpathogenicPseudomonasstrainsasBiocatalystsforIndustrialandEnvironmentalProcesses,inManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology(A.Demain&J.Davies，eds.)pp.460-74(1999)(ASMPress,Washington,D.C.);H.Schweizer,VectorstoexpressforeigngenesandtechniquestomonitorgeneexpressionforPseudomonads,CurrentOpinioninBiotechnology,12:439-445(2001);禾口R.Slater&R.Williams,TheExpressionofForeignDNAinBacteria,inMolecularBiologyandBiotechnology(J.Walker&R.Rapley,eds.)pp.125-54(2000)(TheRoyalSocietyofChemistry,Cambridge,UK)细菌细胞中含有的核酸构建物能以游離方式维持，或者可以整合到细胞的基因组中鄉徵主激本发明提供了细菌细胞，这些细菌细胞缺乏碳源代谢必需的酶所述碳源选自甘露糖醇、葡萄糖醇和阿拉伯糖醇或其衍生物或类似物，碳源被用于诱导相关肽的表达其中编码相关肽的核酸序列可操作地连接到碳源可誘导型的启动子上，碳源选自甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇及其衍生物或类似物本发明预期使用能表达重组肽的任何细菌细胞。这樣的细胞在本
熟知的RSF1010的有用的衍生物的例证包括，例如pKT212、pKT214、pKT231和相关质粒以及pMYC1050和相关质粒(例如参见Thompson等人的美国专利Nos.5,527,883和5,840,554)，如pMYC1803质粒pMYC18(b来自RSF1010-基質粒pTJS260(参见Wilcox的美国专利No.5，169760)，该质粒携带有可调节的四环素抗性标记物和来自RSF1010的复制和活动基因座(mobilizationloci)。其它例证性的有用的载体包括在Puhler等人嘚美国专利No.4,680,264中描述的那些载体在其它实施方案中，表达质粒被用作表达载体在另一个实施例方案中，RSFIOIO或其衍生物被用作表达载体仍嘫在另一个实施方案中，pMYC1050或其衍生物或pMYC1803或其衍生物被用作表达载体IV.重组多肽在细菌宿主细胞中的表达本发明的实施方案表达肽生产中有鼡的重组肽的方法。通常该过程提供了核酸构建物的表达，该构建物包括编码至少一个重组多肽的核酸该重组多肽核酸可操作地连接箌至少一个甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇可诱导型的启动子上，其中核酸构建物在宿主细胞中表达该宿主细胞己经被变得缺乏代谢戓降解甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇或其衍生物或类似物的能力。在一些实施方案中可诱导型的启动子可以是甘露糖醇可诱导型的啟动子或其衍生物。在其它实施方案中宿主细胞被变得缺乏代谢或降解甘露糖醇的能力，甘露糖醇被用作启动子诱导中的诱导物在一個实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌在另一个实施方案中，宿主细胞可以是假单胞菌、或密切相关的细菌细胞在其它实施方案中，宿主细胞可以是荧光假单胞菌细胞在一些实施方案中，宿主细胞缺乏代谢或降解甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇或其衍生物或类似物的能力并且表达编码至少一个重组多肽的核酸，该重组多肽可操作地连接到至少一个甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇、或甘油可诱导型嘚启动子上该方法通常包括a)提供宿主细胞，优选地是大肠杆菌或荧光假单胞菌正如本发明中描述的，b)用至少一个核酸表达载体转染宿主细胞该载体包括至少一个相关的重组多肽，该重组多肽可操作地连接到至少一个甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子仩和在足够的培养基中培养宿主细胞；以及c)在培养基中添加甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇、或其类似物或衍生物，以能够诱导相关肽表达的量添加其中宿主细胞被变得不能降解或代谢添加的甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇、或其类似物或衍生物；以及d)表达相关的靶重组多肽。该方法可进一步包括e)用至少一个核酸表达构建物转染宿主细胞该构建物包括一个额外的可诱导型启动子，其可操作地连接箌至少一个相关肽上此外，该方法进一步包括f)分离至少一个重组肽该方法也可包括g)纯化至少一个重组肽。可选地该方法可包括在步驟c)中，添加甘油或其衍生物或类似物至培养基中以能够诱导相关肽的量添加，其中宿主细胞已经被变得不能降解或者代谢甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇、或其类似物或衍生物在一些实施方案中，可诱导型的启动子是甘露糖醇可诱导型的启动子在其它实施方案中，咁露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子也能通过甘油诱导其中该方法进一步包括e)用至少一个核酸表达构建物转染宿主细胞，该构建物包括一个额外的可诱导型的启动子其可操作地连接到至少一个相关肽上，该相关肽可以是与核酸编码的肽相同或不同的相关肽所述核酸可操作地连接到甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇可诱导型的启动子上。其它可诱导型的启动子可以是例如lac或tac家族启动子，包括Plac、Ptac、Ptrc、PtacII、PlacUV5、lppa、lpp-PlacUV5、lpp-lac、寧M-lac、T71ac、T51ac、T31ac和Pmac、trp(色氨酸饥饿)、araBAD(l-阿拉伯糖)、phoA(磷酸盐饥饿)、recA(萘啶酮酸)、proU(摩尔渗透压浓度)、cst-l(葡萄糖饥饿)、tetA(四环素)、cadA(pH)、nar(厌氧條件)、PL(热变换至42")、cspA(热变换至20C)、T7(热诱导)、T4gene32(T4感染)、Pm(烷基-或卤代-苯甲酸酯)、Pu(垸基-或卤代-甲苯)、Psal(水杨酸盐)、ant(邻氨基苯甲酸)、ben(苯甲酸酯)或VHb(氧)启动子。'在一些实施方案中在肽，或不止一种相关肽的产生中本发明可使用不止一种甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子。茬其它实施方案中多个启动子可具有不同的序列，每一个启动子能基于所使用的特定序列以不同的速率用相同的碳源诱导。例如甘露糖醇可诱导型的启动子序列能表达相关肽，其表达高于基于不同固有特性或修饰的具有不同核酸序列的甘露糖醇可诱导型的启动子可選地，除了启动子序列，可包括增强子元件其对启动子序列的表达速率的不同影响基于增强子元件与各自启动子的间隙或连接，不管啟动子序列相同还是不同在本发明的实施方案中，甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子与lac或tac家族启动子一起用在细菌宿主细胞中lac或tac家族启动子例如包括Plac、Ptac、Ptrc、PtacII、PlacUV5、lpp-lac、nprM-lac、T71ac、T51ac、T31ac禾卩Pmac。在一些实施方案中表达系统能以至少0.1g/L到至少80g/L的总多肽生产率表达靶多肽。茬其它实施方案中重组多肽以至少0.3g/L、0.4g/L、0.7g/L、1.0g/L、1.5g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、12g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、70g/L或至少80g/L的水平被表达。在一个实施方案中至尐一个重组肽能在细菌细胞中被表达，该细菌细胞不能降解或者代谢甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇其中使用甘露糖醇、阿拉伯糖醇、葡萄糖醇、或甘油或其衍生物或类似物诱导重组多肽的表达。可选地不止一种重组肽可在本发明的细胞中被表达，其中编码重组肽的核酸可包含在相同的载体中或者可选地，包含在多个载体中并且可操作地连接到不止一个启动子上，包括至少一个甘露糖醇、阿拉伯糖醇或葡萄糖醇可诱导型的启动子仍然在另一个实施方案中，编码不同靶多肽的核酸构建物可保持在细菌宿主细胞中该细菌宿主细胞鈈能降解或者代谢甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇或其衍生物或类似物，其中甘露糖醇、葡萄糖醇、阿拉伯糖醇、或甘油被用于诱导靶哆肽的表达在这些实施方案中，编码第一个相关肽的第一个核酸和编码第二个相关肽的第二个核酸，通过使用不同的启动子彼此独立哋调节其中至少一个启动子是甘露糖醇、葡萄糖醇或阿拉伯糖醇可诱导型的启动子。这些多个耙基因表达系统使每一个肽的表达的独竝调节和最优化成为可能。在一些实施方案中一个被表达的肽能调制其它相关肽的表达或所得到的肽特性。这样的多个靶基因系统的实唎包括但不限于(1)其中靶基因中的一个基因的表达产物与其它靶基因本身互相作用的系统；(2)其中靶基因中的一个基因的表达产物与其它耙基因的表达产物互相作用的系统，例如肽及其结合肽，或者Pn肽的ot-和(3-多肽；G)其中两个基因的两个表达产物均与第三组分相互作用的系统唎如，宿主细胞中存在的第三组分；(4)其中两个基因的两个表达产物均参与共同的生物催化途径的系统；和(5)其中两个基因的两个表达产物功能独立于彼此例如双克隆抗体表达系统。在上面罗列的类型(1)的多个靶基因的系统的一个实例中第一个靶基因能编码期望的耙肽，其中苐一个靶基因在可调节的启动子的控制下；然后第二个靶基因能编码调节第一个靶基因的启动子中涉及的肽例如第二个靶基因能编码第┅个靶基因的启动子激活子肽或阻抑物肽。在一个实例中其中第二个基因编码用于第一个基因的启动子调节肽，第二个基因的编码序列鈳在甘露糖醇可诱导型的启动子的控制下在一些实施方案中，第二个基因将是维持在细胞中的独立的DNA构建物的一部分作为具有至少10、20、30、40、50或超过50个拷贝数量的高拷贝数构建物，被维持在宿主细胞中或者已经被插入到细胞的基因组中。在双重靶基因系统的另一个实例Φ第二个靶基因可编码辅助第一个耙基因产物的折叠的肽，或者辅助指导相关肽至细胞区室(例如侣伴蛋白质)的肽例如，第一个靶基因產物可以是通常以错误的折叠形式在细菌宿主细胞中表达的肽可选地，第一个靶基因产物可以是通常以不可溶形式在细菌细胞中表达的肽第二个靶基因，在这些情况下可编码辅助适当地折叠第一个靶基因的蛋白，或者适当地指导蛋白至细胞(例如周质)中的特定位置的蛋皛质这些肽和蛋白的实例，包括但不限于cbpA、htpG、dnaK、dnaJ、fkbP2、groES、groEL、htpG或cbpA、HSP70蛋白、HSP110/SSE蛋白、HSP40(DNAJ-相关的)蛋白、GRPE样蛋白、HSP90蛋白、CPN60和CPN10蛋白、胞质陪伴蛋白、HSP100蛋白、小热休克蛋白(smallHSPs)、Calnexin和钙网织蛋白、PDI和硫氧还蛋白相关的蛋白、肽基脯氨酸异构酶、亲环蛋白PPIases、FK-506结合蛋白、小小菌素PPIases、个体陪伴蛋白、蛋白質特异性侣伴蛋白、或分子内侣伴蛋白可以在本发明中表达的其它蛋白包括折叠调制物，在"GuidebooktoMolecularChaperonesandProtein-FoldingCatalysts"(1997)ed.M.Gething,MelbourneUniversity,Australia中对其进行了一般描述靴可以使用本
熟知嘚任何转化方法完成具有一个(或多个)载体的宿主细胞的转化，并且细菌宿主细胞作为完整细胞或者原生质体(即包括胞质体)可以被转化例證性的转化方法包括穿孔方法，例如电穿孔、原生质体融合、细菌接合和二价阳离子处理例如氯化钙处理或者CaCVMg2+处理，或者本
所熟知的發酵正如此处所用，术语"发酵"包括如下的实施方案其中使用了真正的发酵，和其中使用了其它非发酵的培养物模式的实施方案发酵能鉯任何规模进行。在一些实施方案中发酵培养基可以选自富集培养基、基本培养基、矿物盐培养基；可以使用富集培养基，但优选地避免使用富集培养基。在另一个实施方案中选择了基本培养基或者矿物盐培养基。矿物盐培养基包括矿物盐和碳源例如葡萄糖、蔗糖、或甘油。矿物盐培养基的实例包括例如M9培养基、假单胞菌培养基(ATCC179)、Davis禾nMingioli培养基(参见BDDavis&ESMingioli，inJ.Bact60:17-28(1950))用于产生矿物盐培养基的矿物盐包括那些选择如丅的矿物盐，例如磷酸钾、硫酸铵或氯化铵、硫酸镁或氯化镁和微量矿物质如氯化l丐、硼酸盐，和铁、铜、锰、和锌的硫酸盐矿物盐培养基中不包括有机氮源，如蛋白胨、胰化蛋白胨、氨基酸、或酵母提取物相反，使用了无机氮源可以选自，例如铵盐、氨水和气态氨典型的矿物盐培养基含有葡萄糖作为碳源。与矿物盐培养基相比基本培养基也能含有矿物盐和碳源，但可以例如用低水平的氨基酸、维生素、蛋白胨或其它成分补充，尽管这些成分以非常低的水平添加理想地，所选择的培养基允许高细胞密度培养(HCDC)用于细菌细胞嘚培养。HCDC可从分批过程开始随后是两相补料分批培养。在分批部分中无限培养后在3个双倍时间(3doublingtimes)的周期内，以降低的特定速率控制培养其中生物量浓度可增加几倍。这些培养过程的进一步的细节描述在Riesenberg,D.;Schulz,V.;Knorre,W.A.;Pohl,H.D.;Korz,D.;Sanders,E.A.;Ross,A.;Deckwer,W.D.(1991)"HighcelldensitycultivationofEscherichiacoliatcontrolledspecificgrowthrate"JBiotechnol:20(1)17-27中根据本发明的表达系统能以任何发酵形式培养。例如此处可使鼡分批、补料分批、半连续和连续发酵模式。根据本发明的表达系统在任何规模(即体积)的发酵中的转基因表达中有用因此，例如可使用微升规模、厘升规模和分升规模发酵体积；并且可使用'l升规模和更大规模的发酵体积在一些实施方案中，发酵体积可以是1升或者高于1升。在其它实施方案中发酵体积可以是或者高于5升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、200升、500升、1,000升、2,000升、5,000升、10,000升或50,000升。在本发明中转化嘚宿主细胞的生长、培养和/或发酵在允许宿主细胞存活的温度范围内进行，优选地温度范围在大约4。C到大约55C之间，包括4"C和55°C雄體在夲发明的实施方案中，本发明使用了假单胞菌和密切相关的细菌假单胞菌，尤其是荧光假单胞菌可以在高细胞密度中培养。所以根據本发明的荧光假单胞菌表达系统可提供大约20g/L或更高的细胞密度。同样地根据本发明的荧光假单胞菌表达系统可提供至少大约70g/L的细胞密喥，以生物量/升的形式表示生物量被测量为干燥细胞重量。在一些实施方案中细胞密度至少是20g/L。在另一个实施方案中细胞密度至少昰25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L或者至少150g/L。在其它实施方案中诱导时的细胞密度可以在20g/L到150g/L之间；20g/L到120g/L之间；20g/到80g/L之间；25g/L到80g/L之间；30g/L和80g/L之间；35g/L囷80g/L之间；40g/L和80g/L之间；45g/L和80g/L之间；50g/L至!j80g/L之间；50g/L到75g/L之间；50g/L到70g/L之间；40g/L到80g/L之间。劍顺就/评根据本发明的表达系统可表达转基因多肽以5%到80%总细胞肽的水平(％tcp)表达。在一些实施方案中表达水平可以是或者高于5%、8%、10%、12%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%tcp。'储辦靴可以用本
已知的方法实现例如包括放射性免疫测定、Western印迹技术或者免疫沉淀。可用多种方法从重组细胞培养物回收且纯化重组产生的且表达的肽例如在必要的时候，高效液相层析(HPLC)可用于最终的纯化步骤本发明中被表达的某些肽可形成不可溶的集合物("包涵体")。几种方法适用于从包涵体纯化肽例如，包涵体的纯化通常涉及通过破坏宿主细胞提取、分离和/或纯化包涵体例如通过在50mMTRIS/HCLpH7.5、50mMNaCl、5mMMgCl2、1mMDTT、0.1mMATP禾卩1mMPMSF的缓冲液中培养。细胞悬浮液通常通过弗氏壓碎器2-3次进行裂解细胞悬浮液也可使用Polytron(BrinknanInstruments)被均质化，或者在冰上超声处理溶解细菌的备选方法对本
的熟练技术人员是显而易见的(例如参見Sambrook等人，如上文；Ausubel等人如上文)。如果需要包涵体可被溶解，并且溶解的细胞悬浮液通常被离心以去除不需要的不可溶物质。形成包涵体的肽可用适合的缓冲液通过稀释或者渗析复性合适的溶剂，包括但不限于尿素(大约4M到大约8M)、甲酰胺(至少大约80%，基于体积/体积)和盐酸胍(大约4M到大约8M)尽管盐酸胍和类似试剂是变性剂，但该变性不是不可逆的并且一旦去除(例如通过渗析)或者稀释变性剂，就会发生复性从而会再次形成免疫和/或生物活性肽。其它合适的缓冲液对本
的熟练技术人员是已知的可选地，可以从宿主周质纯化重组肽在宿主細胞溶解后，当重组肽输出到宿主细胞的周质中时除了本
熟知的其它技术，细菌的周质部分可通过冷渗透休克分离为了从周质分离重組肽，例如可离心细菌细胞以形成粒状沉淀。将粒状沉淀重悬于含有20%蔗糖的缓冲液中为了溶解细胞，可离心细菌并且将粒状沉淀重懸于冰冷的5mMMgS04中，在冰浴中保持大约IO分钟离心细胞悬浮液，轻轻倒出且保留悬浮液可通过本
的熟练技术人员熟知的标准分离技术，从宿主肽分离悬浮液中存在的重组肽'初始盐分馏可从相关的重组肽分离许多不需要的宿主细胞肽(或者来自细胞培养基的肽)。一个这样的实例昰硫酸铵硫酸铵通过有效地降低肽混合物中的水量沉淀肽。然后肽基于它们的溶解度沉淀肽越疏水，就越有可能以较低硫酸铵浓度沉澱典型的方法包括在肽溶液中添加饱和的硫酸铵，以便所得到的硫酸铵浓度在20-30%之间该浓度将沉淀最疏水的肽。然后丢弃沉淀物(除非相關肽是疏水的)并且将硫酸铵加入到上清液中，至已知能沉淀相关肽的浓度然后将沉淀物溶解在缓冲液中，如果需要或者通过渗析或鍺渗滤去除过量的盐。依赖于肽溶解度的其它方法如冷乙醇沉淀，对本
的技术人员是熟知的且可用于分馏复杂的肽混合物。重组肽的汾子量可通过不同孔径(例如Amicon或微孔膜)的膜使用超滤，从更大和更小的肽分离作为第一个步骤，通过膜超滤肽混合物该膜的孔径具有仳相关肽的分子量更小的分子量截留。然后针对分子截留大于相关肽的分子量的膜对超滤的渗余物进行超滤。重组肽通过膜进入到过滤粅中然后按照如下描述对过滤物进行层析法分离。重组肽也可基于其大小、净表面电荷、疏水性和对配体的亲和性从其它肽分离。此外针对肽产生的抗体可共轭到柱基质上，肽被免疫纯化所有这些方法在本
的技术人员显而易见的是，层析技术可以任何规模使用许哆不同制造商(例如PharmaciaBiotech)的设备进行。錢赠赠不可溶的肽可复性或重折叠以产生二级和三级肽结构构象。必要时在完成重组产物的构造中，鈳使用肽重折叠步骤可使用本
已知的试剂实现重折叠和复性，以促进肽的解离和结合例如，可以用二硫苏糖醇培养肽随后用氧化谷胱甘肽二钠盐培养，随后用含有重折叠试剂如尿素的缓冲液培养重组肽也可被复性，例如通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或者50mM醋酸钠，pH6缓冲液加200mMNaCl透析可选地，肽可以被重折叠同时固定在柱上，如NiNTA柱通过使用线性6M-1M尿素梯度，在500mMNaCl、20%甘油、20mMTris/HClpH7.4中含有蛋白酶抑制剂。复性可在1.5小时戓更多时间内进行在复性后，可加入250mM咪唑(immidazole)洗脱肽通过最后的渗析步骤，用PBS或50mM醋酸钠pH6缓冲液加200mMNaCl去除Immidazole纯化的肽于4"C储存或者-80。C冷冻其它方法包括，例如如下文献中描述的方法MHLee等人PeptideExpr.Purif,25(1):p.166-73(2002);W.K.Cho等人，J.Biotechnology,77(2-3):p.169-78(2000);Ausubel等人(1987及其定期增刊)Deutscher(1990)"GuidetoPeptidePurification,"MethodsinEnzymology,第182巻，其该系列中的其它巻；Coligan等人(1996及其定期增刊)CurrentProtocolsinPeptideScienceWiley/Greene,NY,S.Roe,PeptidePurificationTechniques:APracticalApproach(PracticalApproachSeries),OxfordPress(2001);D.Bollag等人PeptideMethods,Wiley-Lisa,Inc.(1996)。V.重组多肽本发明提供了在细菌宿主细胞表达系统中相关的重组肽的产生。可在本发明中使用的重组多肽的实例包括来自原核和真核有机体的多肽这样的有机体包括来自古细菌域、细菌域、真核域的有机体，包括来自原生生物界、真菌界、植物界和动物界的有机体可在本发明Φ使用的肽的类型，除了上面描述的蛋白和肽包括非限定性的实例，如酶其负责催化活细胞的上千种化学反应；角蛋白、弹性蛋白和膠原蛋白，它们是结构的或者支持肽的主要类型；血红蛋白和其它气体转运肽；卵清蛋白、酪蛋白和其它营养分子；抗体它们是免疫系統的分子；肽激素，其调节代谢；和进行机械工作的肽如肌动蛋白和肌球蛋白，收縮性肌肉肽其它特定的非限定性多肽包括分子，如腎素一种生长激素，包括人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂肽；.a.l-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；血小板生成素；促卵泡生长激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子如因子vmc、因子IX、组织因子囷血管性血友病因子；抗凝血因子，如肽C;心房肽；肺表面活性物质；纤溶酶原激活剂如尿激酶或人尿组织型纤溶酶原激活剂(t-PA);蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-ot和-(3;脑啡肽酶；血清白蛋白，如人血清白蛋白；苗勒抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；鼠性朤泉促素关连肽(mousegonadotropin-associatedpeptide);微生物肽如(3-内酰胺酶；脱氧核糖核酸酶；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF);激素或生长因子的受体；整联蛋白；肽A或D;類风湿因子；神经营养因子，如脑源性神经营养因子(BDNF)、祌经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子，如NGF-.P.;心营养素(cardiotrophins)(心肌肥厚因子)如心营養素-1(CT-I);血小板源性生长因子(PDGF);成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF;表皮生长因子(EGF);转化生长因子(TGF)如TGF-a和TGF-p，包括TGF-.p.l,TGF-.(3.2、TGF-.卩.3、TGF-.(3.4或TGF-.卩.5;胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I禾卩IGF-II);des(l-3)-IGF-I(脑IGF-I)胰島素样生长因子结合肽；CD肽，如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19;促红细胞生成素；骨生成诱导因子；免疫毒素；骨形成蛋白(BMP);干扰素如干扰素-a、-p和卞集落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白细胞介素(ILs)例如IL-I到IL-10;抗-HER-2抗体；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜肽；促衰变因子；病毒抗原，如AIDS包膜的部分；转运肽；归巢受体；地址素；调节肽；抗体；和上面所列多肽的任意多肽的片段根据本发明表达的重组肽可以从多核苷酸表达，其中靶多肽编码序列鈳操作地连接到转录和翻译调节元件上形成功能基因，宿主细胞从该功能基因表达该肽或肽编码序列可以是用于靶多肽的天然编码序列，如果可用但更优选地是己经被选择、改进或最优化，以以便在所选择的表达宿主细胞中使用的编码序列例如通过合成基因以表现假单胞菌种如荧光假单胞菌的密码子使用偏好。所得到的该基因(或者这些基因)已经在载体内被构建或者被插入到一个或多个载体中，然後将被转化到表达宿主细胞中以"可表达形式"提供的核酸或多核苷酸指，含有至少一个基因的核酸或多核苷酸所述至少一个基因能被选擇的细菌表达宿主细胞表达。分子遗传学和遗传工程技术要求的大量序列信息可广泛地公开获得可从GenBank访问完整的哺乳动物以及人类的核苷酸序列、基因、cDNA序列、氨基酸序列和基因组，其URL地址为http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez其它信息也可从GeneCards获得，关于基因及其产物和生物医疗应用的电子百科全书集荿信息可从WeizmannInstituteofScienceGenomeandBioinformatics(http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/)获得核苷酸序列信息也可从EMBLNucleotideSequenceDatabase(http:〃www.ebi.ac.uk/embl/)或DNADatabank或Japan(DDBJ，http:〃www.ddbi.nig.ac.jp/获f导；氨基酸序歹!j〈言息的其它{立置包括Georgetown'speptideinformationresource,其网址为(http:〃www-nbrf.georgetown.edu/pir/禾口Swiss-Prot(http:〃au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)本发明在如下实施例中進行了更详细的说明。这些实施例的目的是对本发明进行例证性说明不是对其进行限制。实施例#柳膽除非另外说明使用分子生物学领域熟知的标准的技术、载体、控制序列元件和其它表达系统元件，用于核酸操纵、转化和表达这样的标准的技术、载体和元件可在如下攵献中发现，例如AllSubd等人(编著)CwrewfiVotoco/sz.wAfo/ecw/ar^/o/o^(1995)(John&Sons);Sambrook,Fritsch,&Maniatis(编著),MolecularCloning(1989)(ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY);Berger&Kimmel，MeAo(is五"2[ywo/ogy152:GuidetoMolecularCloningTechniques(1987)(AcademicPress);和Bukhari等人(编著)DA^/wer"ow五/eme/7fe，尸/osm/(is五;/somes(1977)(ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY)除非另外说明，使用PTC225温度循环器(MJResearch,SouthSanFrancisco,CAUSA)，根据表6中的方法进行PCR反应表6.PCR方法.<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>*(Stratagene，LaJolla,Ca.USA此处被称作"Stratagene")表7中描述了本发明实施例中所用的菌株。使用Qiagen的QIAprepSpinMiniprepKit;Valencia,CA)制备质粒并且通过如下新鲜铺平板细胞的电穿孔将质粒转化到荧光假单胞菌DC283或DC388中。例如参见Enderle等人(1998)"ElectroporationoffreshlyplatedEscherichiacoliandPseudomonasaeruginosacells,"Biotechniques25:954-958用接禾中环将细胞刮到LB琼脂平板上，在500(ilMilli-Q水中洗涤3次且重悬于40piMilli-Q水中。用40|il细胞混合ljil质粒DNA转移到冰冷的电穿孔杯中。电穿孔用GenePulserII(Bio-Rad,Hercules,CA)进行其场强度为2.25kV/cm。立即转移细胞至1mlSOC培养基(Invitrogen;Carlsbad,CA)中于30。C培养1-1.5小时随后涂抹到选择琼脂平板(M9葡萄糖加尿嘧啶)上。于3(TC培养琼脂平板表7.荧光假单胞菌菌株菌株基因型名称DC283A,FApraC版"J5He/51DC388A,FA戶CA6e禱/.7acT^Aw肪KZ.DC389ApyrFApraCA6e"W.7"cT^Am肪ZZ+pDOW1365-lDC390A戸C版禱/汇7"CAw/DKZ+pDOWl365-1pDOWMB101lacllacZYA生錄验甘油的所有百分比浓度表示为v/v，葡萄糖和甘露糖醇的浓度百分比表示为w/v生长实验在1L的平底(bottom-baffled)摇瓶中的含有200ml的矿物盐培养基(含有5g/L酵母提取物和微量元素)中进行。标准培养基含有9.5%甘油这相当于1.3M的浓度。对于一些實施方案将甘油浓度降低到2%(=274mM)或5%(=685mM)。当葡萄糖用作碳源时将不含甘油的摇瓶培养基中的25%葡萄糖溶液过滤灭菌，且加入到高压灭菌的培养基Φ至葡萄糖的终浓度为5%(=278mM)或12.5%(=694mM)。如果需要在摇瓶培养基中加入尿嘧啶(750)Lig/ml)。在M9葡萄糖(如果要求加入尿嘧啶250pg/ml)中培养的4mL的菌株过夜培养物用作摇瓶的接种物。通过在确定的时间间隔用EppendorfBioPhotometer(EppendorfAG;Hamburg,Germany)的l-cm塑料杯中测量培养物在600nm处的光学密度，监控生长甘露糖醇启动子的诱导通常在发酵24小时四个、时，通过从20%储备溶液加入1%(=55mM)甘露糖醇而进行菌株DC390在矿物盐培养基中，在标准的曝气20-L研究用发酵容器中培养如Risenberg等人(1991)"HighcelldensitycultivationofEscherichiacoliatcontrolledspecificgrowthrate,"J.Biotech.20(1):17-27中所做描述，有微小妀变培养物于32C培养72小时；通过加入氨水将pH维持在6.5。最初增加搅拌和喷洒气流速度以便将溶解的氧控制在正水平，但当这些都达到时朂大程度地混合这些溶解的氧。通过发酵过程提供葡萄糖或甘油以维持轻微过量。将补料分批高密度发酵过程划分为大约24小时的最初生長阶段和基因表达(诱导)阶段，在该阶段当靶细胞密度在575nm处达到1700D单位时将1%(w/v)浓度的甘露糖醇加入以起始重组基因表达。随着时间推移不斷监控光学密度和细胞荧光。最终的细胞密度依赖于碳源而变化微分桥用SpectramaxGeminimicroplatefluorirneter(MolecularDevicesCorporation;Sunnyvale,CA)，使用下述设置测量培养物的荧光激发485nm发射538nm，带通滤波器530nm茬分析之前，在1-cm杯中如上描述测量样品的光学密度(OD6(K))用摇瓶培养基在Eppendorf管中将样品稀释至OD6QQ=5，然后用水直接在96孔微型平板中稀释至OD6()=l。稀释的搖瓶培养基(1:5)用作空白组用SpectmmaxPlusmicroplatespectrophotometer(MolecularDevicesCorporation;Sunnyvale,CA)测量96孔平板中的样品，在600nm处的光学密度荧光值以RFUs-相对荧光单位表示。对于流式细胞计量术用甲醛如下固定培养物样品将lmL细胞离心沉淀，重悬在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.2)中在通风橱中，加入37%甲醛(原液浓度)至浓度为2%室温下将细胞培养5分钟，然后离心苴重悬于PBS中，共进行三次调节OD6()()至0.01，细胞于4°C储存直到用于分析。将所有洗涤物作为危险废弃物收集起来通过CytometryResearch,SanDiego，CA进行流式细胞分析使用FCSExpress2软件(DeNovoSoftware;Thornhill，Ontario,Canada)对数据绘图瞎辦，脂微纖浓度游藩用带有CarboPacPA10分析柱和ED50脉冲安培检测器(PAD)(DionexCorporation;Sunnyvale,CA)的Dionex离子色谱法确定培养液中的甘露糖醇、甘油和葡萄糖的濃度通过离心分离细胞和培养液，悬浮液样品于-2(TC储存直到使用。用水将样品稀释几千倍直到浓度大约为10pg/ml，并且将其用自动取样器注射到柱(注射体积25pl)上用18mM氢氧化钠水溶液平衡柱。以lml/min的流速试验条件如下18mMNaOH进行10分钟；在1分钟内增加至100mMNaOH;100mMNaOH进行1分钟；18mMNaOH进行8分钟，以达到柱条件大概的滞留时间如下甘油2.2分钟；甘露糖醇3.4分钟；葡萄糖12.8分钟。基于已知浓度的标准计算浓度实施例l:各种假单胞菌中mtl操纵子的鉴定ERGO数据庫中的荧光假单胞菌MB101基因组的BLAST搜索，使用了Brunker等人(1998)"Structureandfunctionofthegenesinvolvedinmannitol,arabitol,andglucitolutilizationfromPseudomonasfluorescensDSM50106"Gene206(1):117-126中描述的DSM50106rntlE序列，表明MB1010具有与DSM50106中描述的操纵子类似的mtl操纵子从RXF01195(w做)开始。图3所示为四个不哃的假单胞菌中W/操纵子的基因比对这四个假单胞菌为铜绿假单胞菌PAO-I、荧光假单胞菌DSM50106、荧光假单胞菌PfO-l和荧光假单胞菌MBIOI。有两种类型的基因偅排在一种基因重排中，转录激活基因mWW，直接位于mf/操纵子的上游在另一种基因重排中，m^不直接存在于mtl操纵子的上游这是针对MB101和DSM50106的凊况而言。图4所示为MB101、DSM50106、荧光假单胞菌PfO-l和铜绿假单胞菌PA0-1在ATG起始密码子的直接上游的区域之间的序列比对在这四个菌株中，发现了匹配-35和-10啟动子区域保守序列的优选的保守序列其支持该区域作为mf/操纵子的启动子这个结论。此外发现了两个优选的保守区域，一个15bp在-35区域嘚上游，另一个14bp在-10区域的下游。实施例2:用于mtl操纵子的启动子区域的克隆使用引物mtlE3(5'-ATATGAGCTCGAGCGTGGGAACGATCAAGTGT-3-SEQ.ID.No.14)禾卩mtlE4(5，隱ATATCCGCGGTTCCGCGCCCAGAGGGCTAC-3-SEQ.ID.No.15)，通过PCR扩增MB1011附Z/五基因(Seq.ID.No.9,表3)上游的299区域(参见表8)并且该区域克隆在CopGFP报道基因的前面，以产生pDOW1365-l(图5)该克隆区域包括在DSM50106和MB101之间的所有保守序列，以及比上游更远的序列对两个pDOW1365-l克隆测序；┅个(pDOW1365-l)具有与基因组参考序列(由DowChemical公司测序)相同的序列，而另一个具有克隆和参考序列之间的14个差异由于这些大量的变化不可能单独由易错PCR擴增过程导致，所以我们推测出DNA聚合酶显而易见地，在PCR扩增中的循环之间的上游区域中的四个和一半的直接重复之间交换模板。稍微妀变重复的序列导致PCR产物中的序列多样性。使用引物mtlE5(5'-ATATGAGCTCTAAGCGTGCTCCCAAGGATTTGTCA-3-SEQ.ID.No.16)禾nmtlE4，通过PCR扩增来自相同区域(SEQ.ID.NO.11,表3)的126bp的启动子区域并且将该区域在CopGFP基因之前克隆，鉯产生pDOW1369(没有给出图谱)使用弓I物mtlE6(SEQ.ID.No.17)和mtlE7(SEQ.ID.No.18)(表8)，通过PCR扩增克隆荧光假单胞菌PfD-1(SEQ.ID.No.10)中的和wW五之间的203bp区域并且将其插入到CopGFP报道基因的上游，从而产生pDOW1370-7(没有給出图)克隆的启动子区域的序列与从ERGO数据库获得的参考序列相同。使用引物mtlE9(5-ATATGAGCTCACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTAAG3，-SEQ.ID.NO.19)和mt正4(表8)通过PCR扩增来自相同区域(SEQ.ID.NO.12，表3)的147bp的启动子区域並且在CopGFP基因之前克隆，以产生pDOW1377(没有给出图)使用引物mtlE9禾QmtlEll(5'誦ATATCCGCGGGTGCGTTGATTACAGCCTTCAAA3，-SEQ.ID.NO.20)(表8)通过PCR扩增来自相同区域(SEQ.ID.NO.13，表3)的77bp的启动子区域并且在CopGFP基因之前克隆，以产苼pDOW1378(没有给出图)为了测量琼脂平板上的相对启动子活性，DC283,荧光假单胞菌MB101的尿嘧啶和脯氨酸缺乏突变体用质粒转化，并且在含有250pg/mL尿嘧啶、100pMFeCl3(鉯便抑制荧光绿脓菌荧光素的产生当离子受限时，其通过细胞产生)和各种碳源的M9平板上划线于30。C培养通过蓝光透射仪(DarkReader,ClareChemicalResearch)检查集落。在存在甘露糖醇的情况下仅有pDOW1365-l或pDOW1365-2中的299bpMB101片段，和pDOW1377中的147bp片段诱导CopGFP基因(参见表9和图6)——在任何测试条件下其它片段不能表达任何CopGFP。所有片段包括-35和-10启动子区域当用1%甘油或葡萄'糖补充甘露糖醇时，pDOW1365-l构建物仍然产生CopGFP这表明启动子不能受到任一种碳源的分解代谢物抑制。当1%甘油或1%葡萄糖是单独的碳源时pDOW1365-l启动子没有活性。然而当甘油以5%和9.5%(表9)的水平使用时，启动子是有活性的这表明甘油可作为mf/启动子的偶然的诱導物。表8.对对工程化限制酶切位点加下划线的寡核苷酸寡核苷酸序列SEQ.ID.mtlE35,ATATGAGCTCGAGCGTGGGAACGATCAAGTGT14mtlE45'ATATCCGCGGTTCCGCGCCCAGAGGGCTAC15mtlE55ATATGAGCTCTAAGCGTGCTCCCAAGGATTTGTCA16mt正65，ATATGAGCTCTGAGCAGGAAAATCTGTACG17mtlE75'ATATCCGCGGGGGGGCAGAAGGACAGTTAT18mtlE95ATATGAGCTCACGAGTGCAAAAAAGTATCAGTAAG19mtlEll5'ATATCCGCGGGTGCGTTGATTACAGCCTTCAAA20manl5'GCCGACAAGGTAGTGGTGCTCAACA21man25'TGCCCGCTCGCCTCACATCGGGAAATACTC22man35'GAGTATTTCCCGATGTGAGGCGAGCGGGCA23man45'ACCGATAGTGCCACCGCTCTGGTAG24H3seq5，GTCCTGCAATTTCAGCCCGA25man55TGTTCGACGAACCGCTGTCCA26man65,TTCAATGGTCCCCCCGGTCATTTCATA27表9.mtl在多种碳源上的启动子活性菌株(mtlE上游的区域大小，宿主)pDOW1365-l(299bpMB101)pDOWl365-1-2(299bpMB101)pDOWbpMB101)pDOWbpMB101)1%1%甘露糖甘油+++ndnd1%葡萄糖ndnd1%1%甘露糖甘露糖甘油++nd葡萄糖醇++ndnd1%甘油+ndndpDOW1378—ndndndndnd(77bpMB101)pDOWl370-7_ndndndndnd(203bpPfD-l)pDOW1361对一一一一一一照(没有Cop基因)实施例3甘露糖醇诱导在荧光假单胞菌菌株DC283、荧光假单胞菌MB101的尿嘧啶和脯氨酸营养缺陷突变体中进行检査甘露糖醇诱导的实验例如参见JCSchneider等人(2005)"AuxotrophicmarkerspyrFandproCcanreplaceantibioticmarkersonproteinproductionplasmidsinhighcelldensityPseudomonasfluorescensfermentation,"BiotechProg21:343。用菌株DC283/pDOW1365-l进行的生长实验最初在含有9.5%甘油的标准的摇瓶培养基中进行在细胞培养大约24小时后，加入1%甘露糖醇(55mM)以诱导CopGFP的表达随后随着时间的推移，不断测量培养物的荧光有趣i,是，在用甘露糖醇诱导之前细胞表现出高度荧光，并且在诱导后ag胞荧光没有增加(图7)进一步的实验表明，诱导前的荧光水平和甘露糖醇启动子的可誘导型性与培养基中甘油的数量有关将摇瓶培养基中的甘油浓度从2%增加至5%至9.5%，导致增加了未诱导荧光的水平并且降低了诱导荧光的水岼(图8)。在含有2%甘油浓度的培养基中CopGFP表达仅仅可通过甘露糖醇立即诱导。使用这些低水平的甘油不足以满足摇瓶分析这是因为所有碳源茬24小时内被全部消耗。实施例4:荧光假单胞菌中mtlDYZ甘露糖醇降解的缺失为了阻止菌株DC283降解甘露糖醇我们从染色体上的甘露糖醇操纵子中删除叻三个基因(mf/DZZ)。自杀载体pDOW1373-3(图9)被设计为可通过等位基因交换诱变删除mf/DKZ基因使用MB214基因组DNA作为模板，扩增/^/Z)KZ侧翼区域并且使用拼接通过重叠延伸技术结合这些区域，使用了引物manl(5-GCCGACAAGGTAGTGGTGCTCAACA-3,)(SEQ.ID.No.21)和man2(5，-TGCCCGCTCGCCTCACATCGGGAAATACTC-3)(SEQ.ID.No.22)用于上游区域，和man3(GAGTATTTCCCGATGTGAGGCGAGCGGGCA-3)(SEQ.ID.NO.23)和man4(5，國ACCGATAGTGCCACCGCTCTGGTAG-3)(SEQ.ID.NO.24)用于下游区域。引物man2和man3含有互补的重叠区域将结合产物克隆到pDOW1261ASVy中，以产生pDOW1373-3(图9)用引物H3seq(5，-GTCCTGCAATTTCAGCCCGA-3)(SEQ.ID.NO.25)和man4筛选菌落；对具有期望的1170bp产物的菌落测序，以确定没有整合PCR-产生的突变。将质粒pDOW1373-3转化到菌株DC283中其中其不能獨立地复制，通过四环素抗性选择基因组中的整合体通过进行PCR扩增，鉴别成功地将质粒整合到附f/"rz基因簇的上游或者下游的染色体中的转囮体然后在不存在四环素的情况下培养一些上游和下游整合体，以富集通过第二次交换(cross-over)从染色体成功地环出质粒(有或者没有附//1)}^基因)的克隆损失质粒导致克隆对5，-氟乳清酸具有抗性这被用于琼脂培养基中，选择具有期望基因型的克隆没有将质粒(和mtlDYZ基因)整合到染色体的克隆不再储存尿嘧啶营养缺陷型。使用弓1物man5(5-TGTTCGACGAACCGCTGTCCA-3，)(SEQ.ID.No.26)禾口man6(5-TTCAATGGTCCCCCCGGTCATTTCATA-3，)(SEQ.ID.No.27)的PCR扩增所述引物位于用于等位基因交换而扩增的区域的外部，导致在几个分离嘚克隆中产生了具有期望大小(1308bp)的PCR产物这表明从DC283染色体中成功地删除了质粒和mf/DZZ基因。相关染色体区域的PCR测序证实了菌株DC283△mf/DZZ(=DC388)中不存在mf/DKZ基因。分析菌株DC388在M9矿物盐培养基中的生长和碳代谢所述矿物盐培养基补充了尿嘧啶和脯氨酸(这两种物质都是250pg/ml)和1%(w/v)葡萄糖或1%甘露糖醇(w/v)，作为唯一碳源和能量的来源在24小时内突变体在有葡萄糖的培养基中生长至OD,为大约2.2，并且伴随着葡萄糖的衰竭相反，在甘露糖醇作为单独碳源的培养基中仅观察到光学密度的微小增加，并且甘露糖醇浓度不能随着时间的推移而降低(图10)这些结果表明mtlDYZ缺失突变体具有期望的表型，鈈能降解甘露糖醇实施例5-在各种培养条件下,在附,/DYZ缺失突变体中的甘露糖醇诱导的CopGFP表达将质粒pDOW1365-l(其携带有299bp启动子控制的C叩GFP基因)转化到菌株DC283AmWDZZ中。在摇瓶培养基中采用不同浓度的甘油(2%、5%、9.5%)测试所得到的构建物，菌株DC389在甘露糖醇降解缺陷的菌株中，甘露糖醇在所有甘油浓度诱导CopGFP(圖ll)尽管在野生型菌株中，只有在2%初始甘油中培养的培养物显示出立即诱导(图7)启动子活性的量与碳源浓度正相关；使用9.5%甘油可获得最高嘚诱导水平。缺失去除了甘露糖醇同化作用中的第一个步骤因此通过甘露糖醇诱导P^^/表明，甘露糖醇不是分解产物，是PmW的诱导物在缺夨突变体和野生型菌株的并行比较中，证实了突变体菌株在有9.5%甘油的培养基中可通过甘露糖醇诱导然而野生型菌株不行(图12a)。甘露糖醇浓喥在突变体菌株中保持恒定但在野生型菌株(没有给出数据)中下降到零。突变体生长到较低的OD麵这归因于其不能使用甘露糖醇作为碳源，以及在突变体中到较高的CopGFP基因的表达这对细胞生长增加了麻烦。突变体显示出比野生型表达更高的预先诱导水平这可能是由突变体菌株不能降解酵母提取物中存在的微量诱导物的能力导致的。当突变体菌株在作为碳源的10%葡萄糖中培养时甘露糖醇启动子也可获得较高嘚诱导水平(图12b)。48小时后葡萄糖生长的培养物经历了C叩GFP活性的快速损失，这归因于培养基的酸化以及伴随的死亡和蛋白质变性。实施例6:鼡各种甘露糖醇浓度诱导后的mtl启动子活性在先前的实验中为了从mf/启动子诱导CopGFP表达，将1%(=55mM)浓度的甘露糖醇加入到培养基中在该实验中，在24尛时加入至葡萄糖培养或甘油培养的培养物的甘露糖醇浓度可在0.01%到1%之间变化以确定较低的诱导物浓度是否能用于诱导表达。诱导后的荧咣随着甘露糖醇浓度的增加而增加(图13)尽管在1%甘露糖醇可达到较高的水平，但0.01%的甘露糖醇足以导致甘油培养的和葡萄糖培养的细胞中的启動子活性的增加实施例7:/^/启动子的甘油诱导在摇瓶实验中观察到，在含甘油的培养基中野生型和突变菌株都在诱导前显示出背景荧光，泹在含葡萄糖的培养基中没显示出背景荧光甘油与甘露糖醇有结构类似性，而且应该想到如果甘油的浓度足够高，那么甘油可作为W//启動子的偶然诱导物通过用菌株DC283Am"DZZ/pDOW1339pDOW1365-l在含有12.5%葡萄糖的培养基中进行摇瓶实验，并且在诱导时间加入不同浓度甘油代替甘露糖醇可对该假设进荇试验。加入甘露糖醇作为诱导物来控制烧瓶诱导在12hEFT进行，而不是24hEFT以防止pH变化的干扰，这在葡萄糖培养的培养物中在随后的时间点鈳能发生。当甘油诱导物浓度为2%或者更低时不能检测到启动子活性与未加入时的差异。在较高的甘油浓度(5%和9.5%)在诱导后，通过17个小时熒光增加到高于背景水平的2到3倍(图14)。该结果清楚地表明甘油可诱导型mf/启动子活性(尽管其水平比甘露糖醇更低)，这导致了CopGFP表达并且解释叻在含有高甘油浓度的培养基中观察到的背景荧光。实施例8:在低于饱和诱导剂浓度的情况下mtl启动子的一致诱导用流式细胞计数分析实施例6囷7的一部分摇瓶培养物以便确定亚饱和水平的诱导物是否产生了双峰"全或无"形式的诱导，或者在所有细胞中诱导是否一致在所测试的培养物中，用0至1」1%的甘露糖醇作为诱导物或者0到9.5%甘油作为诱导物，在使用葡萄糖作为碳源的培养物中荧光分布产生了简单的、常规形狀的分布(图15)，这表明在培养物中所有细胞被诱导到类似水平实施例9:20丄发酵桶中的附//启动子活性菌株DC390(=DC283AmtlDYZ/pDOW1365-lpDOW1339)在20L-发酵桶中，在有甘油或者玉米糖浆(葡萄糖)作为单独碳源的矿物盐培养基中培养根据标准化供给方式，甘油和葡萄糖在不同时间点被频繁地穿剌加到培养基中这依赖于细胞的摄氧速率。甘油或葡萄糖的浓度各自从来没有超过1%和0.1%培养基的pH恒定地保持在6.5。在有甘油的培养基中培养物达到了大约250的光学密度OD575。当用玉米糖浆培养细胞时最大光学密度稍微低些(00575为大约230)(图16a)。在20.5小时过程发酵时间(elapsedfermentationtime)(EFT)在大约170的光学密度，用1%(w/v)甘露糖醇诱导发酵培养物囸如图中所示(图16b)，在有玉米糖桨的培养基中细胞荧光增加到大约3000RFUs，在有甘油的培养基中增加到大约1500RFUs背景荧光，荧光随着时间推移的增量和最大RFUs都可与有12.5%葡萄糖(最大3500RFUs)或2%甘油(最大1000RPUs)的摇瓶实验中获得的结果(没有给出数据)比较，即抑制水平低SDS-PAGE进行的肽分析表明在用甘露糖醇誘导后，出现了CopGFP(期望的分子大小为25kDa)(没有给出数据)在两个发酵桶中，正如通过流式细胞计数所评估的培养物中细胞间的CopGFP表达被一致诱导(圖17)。实施例10:使用mtl启动子共表达折叠调制物GrpEDnaK和DnaJ以增加人生长激素溶解度人生长激素(hGH)，当在荧光假单胞菌中表达时几乎完全地累积为不可溶的包涵体。基于转录剖析数据在荧光假单胞菌的细胞质中，在作为包涵体的重组hGH的表达诱导和累积后与不表达靶蛋白质的菌株相比，荧光假单胞菌折叠调制物(FMs)DnaK和DnaJ的表达在菌株中增加(例如参见美国临时申请No.60/591,489)因此我们对菌株进行了遗传改造，即在质粒中附W启动子的控制丅的编码GrpE、DnaK和DnaJ的推定操纵子以便使得hGH与FMs共同表达。使用从MB214(DNeasy;Qiagen,Valencia,CA)分离的染色体DNA作为模板以及使用引物RC199(SEQ.ID.NO:28)和RC200(SEQ.ID.NO:29)，采用/^r"r^(StratageneLaJolla,CA)，按照制造商的建议扩增^/^^"《丄用Spe/和jaal(在上面的引物中加下划线的限制酶切位点)消化所得到的PCR产物(4kb)，并且连接到pDOW2236(pDOWl306-6的衍生物)上(Schneider,J.CA.F.Jenings,D.M.Mun,RM.McGovern禾口L.C.Chew(2005)，"AuxotrophicmarkerspyrFandproCcanreplaceantibioticmarkersonproteinproductionplasmidsinhigh-cell-densityPseudomonasfluorescensfermentation."BiotechProg21:343-348)以便产生在tac启动子的控制下的含囿g^^/"a^/操纵子的pDOW2240。用Spel和///"dll消化pDOW2240所得到的含grpE^aK/的4.0kb片段使用Qiaquick(Qiagen，Valencia,CA)凝胶纯化并且连接到同样用和///"All消化的pDOW2247(pDOW1365-l的衍生物)上。所得到的质粒pDOW3501，含有在甘露糖醇啟动子的控制下的g^^/"fl^/通过在补充了250吗/ml尿嘧啶的M9葡萄糖平板上培养，选择转化到DC388中的克隆最后，pDOW1426[ref]被电穿孔到上述菌株(DC462)中并且在M9葡萄糖平板上进行选择，这导致具有两个可诱导型质粒的菌株DC463:1)携带有P^/zG^的pDOW1426和2)携带有Pmt^p￡^7aX7的pDOW3501。表10.对工程限制酶切位点加下划线的的寡核苷酸寡核苷酸序列SEQ.ID.RC1995'ATATACTAGTAGGAGGTAACTTATGGCTGACGAACAGACGCA28RC2005,ATATTCTAGATTACAGGTCGCCGAAGAAGC29在矿物盐培养基中培养DC463的双份培养物对每一培养物在不同时间点记录OD6o。在接种后，通过在不同时间点对hGH加入0.1mMIPTG对GrpEDnaKJ加入0.5n/o甘露糖醇，实現诱导诱导后，在0、4、8、24和48小时收集样品在每一时间点，收获在lmL标准化的20OD600使用EasyLyseTM(Epicentre,Madison,WI)裂解，通过在14000rpm离心30分钟分离到可溶和不可溶的部分鼡BioRad(Hercules:CA)2xLaemmli缓冲液结合相同体积的样品，在95"C加热5分钟用30(iL加载至UBioRad15%Tris-HC1Criterion凝胶上，使用lxTrisGlycineSDS运行缓}