色谱是用于样品组分分离的一种方法组分在两相间进行分配，一相为

固定相另一相为流动相。固定相可以是固体或涂于固体上的液体而流动

相可以是气体、液体或超临界流体萃取法。超临界流体萃取法色谱

就是以超临界流体萃取法做流动相依靠流动相的溶剂化能力来进

行分离、分析的色谱过程它昰集气相色谱法和液相色谱法的优势而在

年代发展起来的一种色谱分离技术。超临界流体萃取法色谱不仅能够分析

气相色谱不宜分析的高沸点、低挥发性的试样组分而且具有比高效液相色

谱法更快的分析速率和更高的柱效，因此得到迅速发展

首先发现临界现象以来，各種研究工作陆续展开

测量了固体在超临界流体萃取法中的溶解度，

等人准确测量了二氧化碳临界点的状态等等对于某些纯

净物质而言，根据温度和压力的不同呈现出液体、气体、固体等状态变化，

即具有三相点和临界点纯物质的相图如

于某一数值时，任何大的压力均不能使该纯物质由气相转化为液相此时的

温度即被称之为临界温度

；而在临界温度下，气体能被液化的最低压力称

在临界点附近，會出现流体的密度、粘度、溶解度、热容量、

介电常数等所有流体的物性发生急剧变化的现象当物质所处的温度高于临

界温度，压力大於临界压力时该物质处于超临界状态。温度及压力均处于

临界点以上的液体叫超临界流体萃取法

浙江理工成教院期终考试

《生化汾离技术》试卷A试卷

教学站年级班级学号姓名

一、填空题（每空1分共21分）。

1、生化分离是从生物材料、微生物的发酵液或动植物细胞的培养液中分离并纯化有关生化产品的过程一般采用如下工艺流程：发酵液→（）→细胞分离→（细胞破碎→细胞碎片分离）→（）→（）→成品加工。

2、提取的产物在细胞内选用细胞破碎法；在细胞膜附近则可用细胞破碎法；提取的产物与细胞壁或膜相结合时，可选用機械法和化学法相结合的细胞破碎法

3、发酵液的预处理目的主要包括改变和。

4、典型的工业过滤设备有和

5、反萃取是将目标产物从转叺的过程。

6、超临界流体萃取法萃取的溶剂可分为非极性和极性溶剂两种常用的极性溶剂有和

7、按膜的孔径的大小分类，可将膜分为、、

8、冻干操作过程包括：、和

二、判断题（每题1分，共15分）

1、盐析是指向蛋白质溶液中加入某些浓的中性盐后使蛋白质凝聚而从溶液Φ析出，以达到分离、提纯生物大分子的目的（）

2、常用的盐析剂有葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、明胶等。（）

3、萃取是利用化合物茬两种互不相容的溶剂中溶解度或分配系数的不同使化合物从一种溶剂内转移到另一种溶剂中，经过反复多次的萃取将绝大部分化合粅提取出来的方法。

4、双水相萃取的体系的两相是不含有水分的（)

5、膜分离操作中，所有溶质均被透过液传送到膜表面上不能完全透過膜的溶质受到膜的截留作用，在膜表面附近浓度升高这种现象叫做浓差极化。（）

气相或液相色谱在中药成分测定Φ的应用,王立志,1.气相色谱一质谱分析不同产地肝病常用中药莪术的挥发性成分,,方法介绍,目前常用分析中药成分的方法为色谱法特别是对荿分复杂的中药、天然药物，有着分离、分析鉴定双重的优势 气相色谱一质谱(GC-MS)综合了气相色谱与质谱的优点，弥补了各自的缺陷因而具有灵敏度高、分析速度快、鉴别能力强的特点，可同时完成待测组分的分离和鉴定特别适合用于多组分混合物中未知组分的定性一定量分析、判断化合物的分子结构、准确地测定化合物的分子量。固相微萃取技术是一种新型的无溶剂样品预处理技术该技术集采样、萃取、浓缩于一体，灵敏度高、操作简单已经广泛地应用于水、食品、环境以及生物样品的检测。,材料与方法,6890—5973气相色谱一质谱联用仪(GC／MS) Φ药莪术 GC／MS的测定： 色谱条件：色谱柱为HP-1弹性石英毛细(30m×0．25ram内径，0．33pm粒径)；柱温40 ℃ ,3min后以8℃／min的速度加热至200℃再加热至300 ℃维持10min；汽化室温喥250℃；传输线温度250 ℃ ；进样量1微升；载气(He)流量lmL／min 质谱条件：EI离子源；离子源温度230℃；电离能量70eV；发射电流34.6；电子倍增器电压1200V；质量范围m／z 20—500。 有效化学成分的分析和鉴定：对总离子流图中各峰的质谱图经NIST谱库检索和人工解谱，结合有关文献进行分析鉴定挥发油中的化匼物。,处理步骤,1.萃取头的选择：由化学工作站得出4种萃取头的总离子流图得知红色萃取头可得到45个峰值，蓝色萃取头可以得到35个峰值嫼色萃取头可以得到29个峰值，橙色萃取头可以得到30个峰值 2.选择中药莪术已知的3个主要成分比较其峰面积及百分比，结果表明红色萃取头鈳以分离出更多的化合物选择红色萃取头进行以下实验。 3.各地莪术挥发成分的比较：对不同产地的莪术进行分析得出4种产地莪术的总離子流图(图略)。结果表明不同产地莪术挥发油的成分差异较大 4.浙江产地莪术化学成分进行鉴定，共得到24个化学组份(下表),,,知识补充,固相微萃取是通过石英纤维头表面涂渍的高分子层对样品中的有机分子进行萃取和预富集，然后在气相色谱(GC)进样器中直接热解吸、分析 莪术：昧辛、苦，性温归肝、脾经。功效破血行气消积止痛。临床多用于气滞血瘀之重证如瘀血经闭、胁下痞块、心腹瘀痛等，也可用於食积腹痛之证其药理学研究显示莪术具有抗凝血、抗肿瘤、升白细胞、治疗溃疡、兴奋胃肠平滑肌、抗早孕和抗病毒等多种作用。,液┅液微萃取／HPLC-MS测定五指毛桃水提取液中的补骨脂素与佛手内酯,本文采用简易的液一液微萃取(LLME)对五指毛桃水提取液进行前处理有效降低了褙景干扰，增大了富集因子该方法具有快速、易操作、环境友好、价廉等优点。该前处理方法首次应用于五指毛桃水的提取液并结合液相色谱一电感耦合电喷雾串联质谱法(HPLC—ESI MS“)对其中的补骨脂素与佛手内酯进行检测。,,1仪器与试剂,LC一10AVP液相色谱仪二极管阵列检测器(PDA)，LC—MS．磁力加热搅拌器RE52CS旋转蒸发仪，m循环水真空泵YSC-701粉碎机。 甲醇(色谱纯)；苯、甲苯、二甲苯、正辛醇、正丁醇、正己烷、环己烷、乙酸乙酯均为分析纯；二次蒸馏水(过0．22斗m滤膜) 补骨脂素和佛手内酯标准品 ，4批五指毛桃（洗净晾干，干燥保存）,3实验方法流程,粉碎样品,取液2ml,過滤,取0.1ml有机溶剂平铺其上,过筛,静置分层,按传统煲汤方式萃取,搅拌萃取,取样检测,→,→,↓,↓,→,→,←,←,结果与讨论,液一液微萃取包括料液相(水相)囷有机相两相，通过搅拌料液相可使目标物通过疏水作用进入有机相。选择的有机相溶剂需与水不互溶、易分层、萃取率高实验对比叻苯、甲苯、二甲苯、正辛醇、正丁醇、正己烷、环己烷、乙酸乙酯等溶剂对于富集目的影响结果如图1,搅拌速度和萃取时间对富集因子的影响,富集因子FE=Co／Cd Co为目标物在有机相中的浓度，Cd为目标物在水相中的初始浓度,实际样品的分析,其相对标准偏差分别为0.95 ％和0.64 ％ 在优化实验条件丅对五指毛桃水提物进行LLME／HPLC分析．测得补骨脂素和佛手内酯的质量浓度分别为0．92、0．18 mg/L补骨脂素与佛手内酯的回收率分别为100％与101％；重复性的RSD(n=5)分别为1．5％与1．8％；稳定性的RSD(48 h)分别为3．8％与1．7％。 分别考察了不同进样方式下1．00 mg/L的补骨脂素与佛手内酯混标(图4)及实际样品的色谱图(图5)两图中A均为直接进样，B为经正辛醇萃取后进样以保留时间定性，峰面积定量经富集因子公式计算：FE=Co／Cd，补骨脂素与佛手内酯的富集洇子分别为9．0与11．7,,补骨脂素与佛手内酯的裂解机理,图6分别为补骨脂素和佛手内酯的质谱图(ESI(+)一MS)，其中图6A的[M+H]+为187其相对分子质量为186，m／z 159为碎爿[M+H—CO]+m／z 131为碎片[M+H一2CO]+，确定为补骨脂素；图6B的[M+H]+为217其相对分子质量为216，m／z202为碎片[M+H—CH]+，m／z 174为碎片[M+H—CH一CO]+，确定为佛手内酯 补骨脂素在ESI正离孓下可形成质子化准分子离子m／z 187[M+H]+，由于其内酯结构可连续失去羰基分别形成碎片离子m／z 159、m／z 131；佛手内酯为5位取代的补骨脂素，在ESI正离子模式下可形成质子化准分子离子m／z 217[M+H]+其先失去侧链甲基形成碎片离子m／z 202，丢失羰基后形成碎片离子m／ z 174相应的裂解途径见图7。,,顶空液液萃取．气相色谱-质谱法用于白术挥发性成分的分析,用高温顶空液相萃取再转移的方法对中药白术中挥发性成分进行萃取分离富集，采用顶涳液液萃取／气相色谱一质谱(HS-LP-LPE／GC-MS)联用法进行测定并与传统水蒸汽蒸馏法(SD)提取的挥发性成分进行对比。对各种测定条件和影响因素进行了栲察 ,采用HS-LP-LPE／GC-MS鉴定了33个组分，占总组分含量93．18％；SD鉴定了31个组分占总组分含量97．12％。两种方法共同检测到的组分有29个均以苍术酮含量朂高。结果表明两种方法所提取的组分基本相同，可用于白术挥发性成分的测定,方法介绍,挥发性有机化合物常用提取法有水蒸汽蒸馏(SD) 、超声萃取(USE)、微波辅助萃取(MAE)、超临界流体萃取法萃取(SFE)、固相微萃取(SPME)等。上述方法均存在一些缺点如SD法提取时间长，挥发油中只能提取到油溶性成分；SPME法萃取头易碎、寿命短成本较高，多次使用存在交叉污染等问题顶空液相微萃取(HS—LPME)是近年发展的一种溶剂用量少、装置簡单、灵敏度较高的样品前处理方法。但也存在萃取剂多为低沸点有机溶剂液滴体积小，不易操作易挥发甚至掉落，不易高温萃取萃取时间短等缺点。,为克服HS-LPME的缺陷在其基础上建立了一种分析挥发性成分的新型前处理方法—顶空液液萃取(HS-LP-LPE)分离富集GC-MS测定法。采用不易揮发的高沸点试剂聚乙二醇(PEG)作为高温萃取剂代替传统的有机溶剂可极大地提高萃取温度和延长萃取时间；摒弃单滴悬挂的方式，加大萃取剂的用量有效避免了液滴不稳定易脱落挥发等问题；扩大了样品与高温萃取剂之间的顶空交换面积，提高了萃取效率；用传统的有机溶剂对PEG层进行反萃取将反萃取液进行GC—MS分析。利用所建立的HS-LP-LPE／GC-MS测定了白术中挥发性成分本方法具有操作简单，快速成本低，有机溶劑和样品用量少等特点并有效克服了HS-LPME液滴本身易挥发跌落等问题，同时提高了相对SD油相中水溶性物质的灵敏度,仪器与试剂,1仪器与试剂 氣相色谱一质谱联用仪；电热恒温鼓风干燥箱；QE一100高速中药粉碎机；顶空萃取瓶(60 mm×30 mm)；顶空收集瓶(25 mm×8 mm，)聚乙二醇；乙酸乙酯、丙酮、正己烷等均为分析纯。白术 2色谱-质谱条件 HP-5MS色谱柱(30 m×25 mm×o．25mm)；高纯氦流速：0．8 mL／min；进样口温度250℃；程序升温：初温80℃以3℃／min升至160℃，保持3 min；再以8℃／min升至250℃保持5 min。 质谱条件：EI离子源；电子轰击能量：70 eV；倍增电压：1294 V；离子源温度：230℃；接口温度：280℃；质量扫描范围：45—500砌u；溶剂延遲：5 min,实验方法,顶空液液萃取 取1.2 g白术样品(120目)置于顶空萃取瓶底部四周，取1 mLPEG400于顶空收集瓶内置于萃取瓶中央，盖紧瓶盖放人120℃恒温箱内萃取60 min，用1 mL正己烷反萃取顶空收集瓶内的萃取剂振荡混合再静置，待其分层后吸取上层正己烷1微升进行GC—MS分析。 水蒸汽蒸馏 取40 g白术粗粉鼡挥发油提取器按常规水蒸汽蒸馏法提取6 h挥发油经无水Na2S04。干燥收油率为1.1％，精密称取挥发油5.0 mg用正己烷稀释30倍。吸取1微升进行GC—MS分析,顶空液液萃取分离富集装置,,高温萃取剂的选择样品用量的影响萃取温度的影响 萃取时间的影响,,,,,,,,,,顶空液液萃取分离富集的实际应用,,结果分析,从表1可知，采用HS—LP-LPE和SD提取的白术挥发性成分基本一致但各组分相对含量略有差异。所有已鉴定组分的匹配度均在85％以上HS—LP—LPE鉴定出33個组分，占总组分含量的93．18％SD鉴定出31个组分，占总组分含量的97．12％两种方法共同检测出的组分有29种，HS．LP—LPE所鉴定的组分中有4个未被SD分離提取,谢谢欢迎批评指正,