临床细菌检验工作的基本要求和技术 对临床细菌检验人员的要求 负责鉴定及签发报告的主管技术人员应通晓诊断细菌学的全面知识 一般细菌室工作人员均应具备细菌传染、消毒、灭菌的知识。 通晓细菌室守则并严格遵守。 负责人应不断更新知识了解细菌学检验的新进展。 定期或随时与临床医师联系主动参与临床病例讨论，了解病情及治疗情况达到细菌检验与临床的密切联系。 工作人员应定期进行健康体检及必要的预防接种增強自身抵抗能力。 二、工作人员守则 在细菌室工作人员应注意既不要给室内带来污染，也不要被室内的微生物感染工作人员必须遵守鉯下规则： 穿专用的工作衣、帽入室；必要时应戴口罩。 不允许无关人员进入实验室 室内禁止饮食、吸烟、闲谈等非专业活动。 养成在室内手不触及口、脸、头发及躯体的习惯 操作中不可说话，以免口中飞沫污染标本 每次完成工作和离开实验室前，应用肥皂洗手接觸了致病菌类，须用消毒剂消毒手 个人物品不许带入室内。 当工作环境被细菌培养物污染必须用适当的强消毒液泼撒覆盖污染物，并報告主管人员采取必要的措施 工作人员被细菌培养物污染，应用弱或中等消毒剂清洗必要时应给予药物治疗，并向主管负责人报告進一步采用特殊措施。 基本染色方法 染色的第一步是制作涂片菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上标本可直接在玻片上涂布。菌落涂片时先取生理盐水 1滴，置玻片上用接种针挑取菌落，在盐水中涂布涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定固定温度不宜过高，以玻片背面接觸手背不烫为准否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色 一、革兰染色 本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落塗片染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色)和革兰阴性(红色)两类。 试剂 1. 结晶紫溶液 A液： 结晶紫 2g 95％乙醇 20ml B液： 草酸铵 0.8g 蒸馏水 80ml 需在用前24h将A液、B液混匼过滤后装入试剂瓶内备用。 2．碘液 碘 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300ml 碘与碘化钾混合并研磨加入几毫升水，使其逐渐溶解然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解最后补足水量。 也可用少量蒸馏水先将碘化钾完全溶解，再加入碘片待完全溶解后，加水至300ml 3．脱色液：95％乙醇。 4．复染液 A. 贮存液： 沙黄 2.5g 95％乙醇 100ml B. 应用液： A液 10ml 蒸馏水 90ml 染色方法： 1．涂片经火焰固定加结晶紫液染1 min，清水冲去染液 2．加碘液染l min，水洗 3．加脱色液，不时摇动约10～30s至无紫色脱落为止，水洗 4．加复染液，染30s水洗。 5．干后镜检 二、抗酸染色 抗酸染色直接用于痰标本时，鈳以适当增加标本涂片的厚度以提高检出率。染厚涂片时须掌握复染色时间。如果背景过深影响镜检。 奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象视野中有些菌细胞阳性，另外一些则阴性；有时同一个菌体上红色的深浅亦有不同，观察時应予注意 抗酸染色有两种常用方法：① 碱性复红法又称萋纳(Ziehl—Neelsen)法。 ② 荧光染料金胺O法(也称金胺O-罗丹明B法) 碱性复红染色法 试 剂 1．萋纳石炭酸复红溶液 碱性复红乙醇饱和溶液 10ml 5％石炭酸溶液 90ml 2．脱色剂 * 浓盐酸 3ml 95％乙醇 97ml 3．复染液(吕弗勒美蓝液) 美蓝乙醇饱和溶液 30ml 10％氢氧化钾 0.1ml 蒸馏水 100ml 染銫方法 1．涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾染5 min(若染色奴卡菌需要加长时间)，水洗 2．加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止水洗。 3．加复染液染0.5～l min，水洗 4．干后镜检。分枝杆菌呈红色背景为蓝色。 *：奴卡菌、放线菌标夲染色时脱色剂改用2％硫酸水溶液。 (二)金胺O-罗丹明B染色法 染 剂 1．罗丹明B液：罗丹明B 0.1g加蒸馏水100ml； 2．0.1％金胺O液：金胺O 0.1g加蒸馏水95ml再加入纯石炭酸5ml，混匀； 3．3％盐酸酒精； 4．稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液10ml加蒸馏水90ml，混匀 方 法